升级版线粒体提取试剂盒（组织和细胞通用）

升级版线粒体提取试剂盒（组织和细胞通用）
英文名：Mitochondria-Cytosol Protein Isolation Kit （Upgrade Version）
产品描述：
线粒体制备试剂盒 (Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。
严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。
产品适用：
从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。
产品组成：
Mito Solution  100ml for 50次制备；200ml for 100次制备
产品储存：
−20ºC ，12个月有效
产品说明：
1. 制备高质量线粒体的关键：第一，全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中；第二，快速，微量制备比大规模制备操作更快速，更容易获得完整的线粒体，且得率高；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。破碎效果与组织细胞类型有关；与组织块相比，贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁。用1-3ml小容量玻璃匀浆器(而不是其它破碎装置)上下研磨培养细胞20-30次。玻璃匀浆器须配套选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。正确的匀浆不是旋转研杵，而是上下缓慢推拉研杵，研杵推进和提升过程中细胞遭受压力的剧变而破碎。研磨程度可用相差显微镜进行检查当未裂解细胞在~50%即可。过度研磨会破坏线粒体，而研磨不足将降低线粒体得率；
2. 如果不得不用电动匀浆器(polytron)，可选用6500转，刀头上下进出4次共计10秒。不同的电动匀浆器性能差别甚大，除非步步监测，否则分离结果难以预料；
3. 不同的离心机必须跟据离心力g计算正确的离心转速(允许10%波动)，否则将导致不纯；
4. 进行Western Blot可直接用RIPA裂解液或SDS-PAGE样品缓冲液裂解线粒体；也可先用Mito Solution重悬线粒体，再加入2x SDS-PAGE样品缓冲液；
5. Cytochrome oxidase, Monoamine oxidase, Succinate dehydrogenas, Glutamate dehydrogenase可用作线粒体的标志酶；
6. 重悬线粒体：可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀，也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀具体用量是：约每100mg组织提取的线粒体用50µl，约每5×10^7个细胞提取的线粒体用100µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调；
7. 裂解线粒体后，进行蛋白浓度测定。立即使用或−70ºC保存。