Human FGF20 ELISA Kit

人成纤维细胞生长因子20ELISA检测试剂盒;Human Fibroblast Growth Factor 20 ELISA Kit

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被有Fibroblast Growth Factor 20 （FGF20）捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，HRP 酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物TMB显色，TMB 在过氧化物酶（HRP）的催化下转化成蓝色并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Fibroblast Growth Factor 20 （FGF20）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（0D 值），计算样品浓度。

名称	9 6 T 配 置	备注
预包被96孔酶标板	8孔×12条	无
标准品	2 支	按说明书进行稀释
通用稀释液	2×20mL	无
浓缩生物素化检抗（100×）	120uL	按说明书进行稀释
浓缩酶结合物（100×）	120uL	按说明书进行稀释
20×洗涤液	2×10mL	按说明书进行稀释
底 物 （TMB）	10mL	无
终止液	6mL	无
封板膜	4张	无
说明书	1 份	无

血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清 和 其他生物液体

双抗体夹心法

12.5-800pg/mL

实验所需自备试验器材：
1、酶标仪（450nm）
2、高精度加样器及枪头：0.5-10uL、5-50uL、20-200uL、200-1000uL
3、37℃℃恒温箱
4、蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：
血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或 4℃过夜，然后 1000×g离心 20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
血浆：用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于 2-8℃1000×g离心 15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃℃保存，但应避免反复冻融。
组织匀浆：用预冷的 PBS （0.01M,pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织碎。将碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1：9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对应 9mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于 5000×g离心 5~10 分钟，取上清检测。
细胞裂解液：贴壁细胞用预冷 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 离心 5 分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用预冷PBS 清洗 3 次，每 1×10^6 个细胞中加入 150-200uL PBS 重悬（推荐在PBS 中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可适当减少 PBS 体积）并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于 2-8℃，1500×g 离心 10 分钟，取上清检测。
细胞培养上清：请 1000×g离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
其它生物液体：1000xg离心 20分钟，取上清即可检测。

检测前准备工作：
1、请提前 10分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2、标准品梯度工作液配制：加入1mL通用稀释液至冻干标准品中，静置15 分钟待其完全溶解后轻轻混匀（浓度为800pg/mL） ，然后按照以下浓度：800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、0pg/mL进行稀释。
倍比稀释方法 ：取7支EP管 ，每管中加入500uL通用稀释液,800pg/mL的标准品工作液中吸取500uL到第一支EP管中混匀配成400pg/mL 的标准品工作液 ，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔 ，不需要再从倒数第二管中吸取液体，具体如下图。
3、生物素化检抗工作液配制：使用前15 分钟将浓缩生物素化抗体于1000×g  离心 1 分钟，以通用稀释液将  100×浓缩生物素化抗体稀释成 1×工作浓度（例： 10uL  浓缩液+990uL  通用稀释液）  ，现配现用。
4、酶结合物工作液配制：使用前 15 分钟将100× 浓缩酶结合物于 1000×g  离心 1 分钟，以通用稀释液将 100×浓缩 HRP  酶结合物稀释成 1×工作浓度（例：10uL  浓缩液+990uL  通用稀释液）  ，现配现用。
5、1×洗涤液配制：取10mL 20×洗涤液到 190mL  蒸馏水中（从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可放置室温，待结晶完全溶解后再配制）。

操作步骤：
1、从室温平衡 10 分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。
2、加样：分别将样品或不同浓度标准品按照 100ul 每孔加入相应孔中，空白孔加入 100uL 通用稀释液。盖上封板膜后 37℃温育 60 分钟。（建议 ：将待测样本用通用稀释液最低稀释 1 倍后再加入酶标板内测试。从而减少基质效应对测试结果的影响，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。
3、加生物素化抗体：取出酶标板，弃去液体，不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液 100uL ，盖上封板膜后 37℃温育 60 分钟。
4、洗板：弃去液体，每孔加入 300uL 1x 洗涤液，静置 1 分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 3 次（也可用洗板机洗板）。
5、加酶结合物工作液：每孔加入酶结合物工作液 100uL ，盖上封板膜后 37℃ 温育 30 分钟。
6、洗板：弃去液体按步骤 4 洗涤方法，洗板 5 次。
7、加底物：每孔加入底物（TMB）90uL ，盖上封板膜，37℃避光温育 15 分钟。
8、加终止液：取出酶标板，每孔直接加入终止液50uL ，立即在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：
结果判断：
1、计算标准品和样本复孔的平均 OD值并减去空白孔的 OD 值作为校正值。以浓度为横坐标，OD 值为纵坐标 ，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线。
2、若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

成纤维细胞生长因子20是一种蛋白质，由FGF20基因编码。该基因所编码的蛋白是成纤维细胞生长因子（FGF）家族的成员。FGF家族成员具有广泛的有丝分裂和细胞生存活性，并参与各种生物过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭。该基因被证明在正常大脑中表达，特别是小脑。与FGF20相关的疾病包括肾脏发育不良/增生2和肾脏缺失，双侧。其相关途径包括PI3K/AKT激活和p70S6K信号。与该基因相关的基因本体论注释包括生长因子活性和成纤维细胞生长因子受体结合。该基因的一个重要类似物是FGF9。

Human

未开封试剂盒，4°C储存，有效期6个月。

1、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2、洗板不正确可能导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3、消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。
4、底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6、在储存和温育时避免强光直接照射。
7、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
8、不能使用过期产品，不同货号和批号组分不得混用。
9、试剂盒以外来源的重组蛋白可能会出现与本试剂盒抗体不匹配而不被识别的情况。
10、如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。