幽门螺旋杆菌(Hsp58)重组抗原；幽门螺旋杆菌(CagA)

幽门螺旋杆菌(Hsp58)重组抗原；幽门螺旋杆菌(CagA)重组抗原；幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）抗原；幽门螺杆菌抗原

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称 Hp）是一种主要生存在人的胃部及十二指肠内的革兰氏阴性菌，对人体具有危害，以下是关于它的基本情况、检测、预防等方面的介绍：
基本介绍
形态结构：幽门螺杆菌呈螺旋状或 S 形、弧形，具鞭毛，微需氧，对生长环境要求非常严苛，空气中只能存活数小时，通常在胃中发现。
基因组特征：幽门螺杆菌的基因组大小约为 1.6 - 2.1 Mb，含有 1500 - 2000 个基因。其基因组成存在一定的多样性，不同菌株之间的基因序列有差异，这种多样性与菌株的致病性和耐药性等特性相关。
对人体的危害
导致溃疡：幽门螺杆菌凭借其螺旋形结构容易钻透胃黏膜，损伤胃和小肠的保护性内膜，从而使胃酸引发开放伤口，即溃疡。
引发胃炎：长期感染幽门螺杆菌可能导致胃黏膜反复发炎，引发胃痛、胃胀、恶心、呕吐等不适症状。
增加胃癌风险：作为第 Ⅰ 类生物致癌因子，幽门螺杆菌引发的炎症会促进胃部上皮干细胞增殖，进而引发胃部肿瘤。
传播途径
口口传播：这是幽门螺杆菌最主要的传播途径之一。比如共用餐具、水杯、牙具，或者进行接吻等亲密接触，都可能导致幽门螺杆菌的传播。在家庭聚餐、外出就餐时，如果不使用公筷、公勺，很容易通过餐具上的唾液传播幽门螺杆菌。
粪口传播：幽门螺杆菌可随粪便排出体外，如果污染了水源或食物，健康人接触后就可能被感染。例如，在一些卫生条件较差的地区，水源受污染后，人们饮用就易感染幽门螺杆菌。
检测方法
尿素呼气试验：幽门螺杆菌能够产生尿素酶，该酶可分解尿素，因此患者口服含有被标记过的尿素的试剂后，通过检测呼出气体中尿素的分解产物来判断是否感染幽门螺杆菌。这种方法无痛、无创，患者比较容易接受，是目前临床上常用的检测方法之一。
胃镜检查：在做胃镜时，可取胃黏膜组织进行快速尿素酶试验或病理检查，以确定是否存在幽门螺杆菌感染。虽然胃镜检查能直接观察胃部情况，但它属于侵入性检查，可能给患者带来一些不适。
血清学检测：通过检测血液中幽门螺杆菌抗体来判断是否感染过幽门螺杆菌。但是此方法不能区分是现感染还是既往感染。

幽门螺旋杆菌（Hsp58）重组抗原

1. 表达系统
   • 宿主细胞：常选用大肠杆菌表达系统，因其遗传背景清晰、生长繁殖快、成本低廉，便于大规模生产。也有采用酵母表达系统的，可进行更复杂的翻译后修饰，使蛋白更接近天然构象。
   • 载体选择：如使用 pET 系列载体，在大肠杆菌中能实现高效表达。载体上含有强启动子（如 T7 启动子），可被宿主细胞的 RNA 聚合酶识别并启动转录，同时具备筛选标记（如氨苄青霉素抗性基因），便于筛选阳性转化子。
2. 蛋白表达与纯化
   • 诱导条件：以 IPTG 诱导为例，通常 IPTG 浓度在 0.1 - 1 mM，诱导时间为 4 - 8 小时，诱导温度在 25 - 37℃。但具体条件需根据实验优化，低温诱导可能有利于蛋白正确折叠，减少包涵体形成。
   • 表达量：在优化条件下，每升培养物中重组 Hsp58 抗原的表达量可达几十毫克至上百毫克。通过优化培养基成分、培养条件和诱导参数等，可进一步提高表达量。
   • 纯化方法：一般采用亲和层析结合离子交换层析的方法。例如，利用 Hsp58 蛋白上的组氨酸标签与镍柱进行亲和层析，初步纯化后再通过离子交换层析去除杂质，可获得纯度高于 90% 的重组抗原。
3. 抗原特性
   • 分子量：Hsp58 蛋白的分子量约为 58 kDa，通过 SDS - PAGE 电泳检测，其条带位置与预期分子量相符。
   • 免疫原性：将重组 Hsp58 抗原免疫动物后，可诱导产生特异性抗体。通过 ELISA 检测免疫血清中的抗体滴度，一般可达 1:1000 以上，表明该抗原具有良好的免疫原性。
   • 特异性：利用 Western blot 等方法检测，重组 Hsp58 抗原能与幽门螺旋杆菌感染患者血清中的特异性抗体发生特异性结合，而与其他无关病原体抗体无交叉反应，显示出高度的特异性。
   • 稳定性：在 4℃条件下可稳定保存数周，-20℃或更低温度下可长期保存。反复冻融可能会影响蛋白的稳定性，因此建议尽量避免。

幽门螺旋杆菌（CagA）重组抗原

1. 表达系统
   • 宿主细胞：同样常用大肠杆菌或酵母表达系统。大肠杆菌表达系统产量高，但可能存在蛋白折叠不正确的问题；酵母表达系统则能更好地进行糖基化等翻译后修饰，使抗原更接近天然结构，免疫原性可能更好。
   • 载体选择：对于 CagA 抗原表达，可选择 pGEX 系列载体，将 CagA 基因与谷胱甘肽 - S - 转移酶（GST）基因融合表达，便于利用 GST 标签进行亲和纯化。也可选择带有其他标签（如 His 标签）的载体，根据后续纯化和检测需求而定。
2. 蛋白表达与纯化
   • 诱导条件：若采用大肠杆菌表达，IPTG 诱导浓度一般在 0.2 - 0.5 mM，诱导时间 6 - 10 小时，诱导温度 20 - 30℃。对于酵母表达系统，通常采用甲醇诱导，甲醇浓度、诱导时间和温度需根据具体酵母菌株和表达载体进行优化。
   • 表达量：优化表达条件后，每升培养物中 CagA 重组抗原的表达量可达数十毫克。通过优化发酵工艺、调整培养基成分等措施，可提高其表达水平。
   • 纯化方法：如果是融合表达 GST - CagA 蛋白，可先用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析进行纯化，然后通过蛋白酶切割去除 GST 标签，再进一步通过凝胶过滤层析等方法进行精细纯化，以获得高纯度的 CagA 重组抗原，纯度通常可达 95% 以上。
3. 抗原特性
   • 分子量：CagA 蛋白分子量较大，约为 120 - 145 kDa，具体大小因菌株差异和翻译后修饰不同而略有不同。在 SDS - PAGE 电泳中，可观察到相应大小的条带。
   • 免疫原性：CagA 是幽门螺旋杆菌的重要毒力因子，具有较强的免疫原性。免疫动物后，能诱导产生高滴度的特异性抗体，ELISA 检测抗体滴度可达 1:5000 以上，且产生的抗体能识别天然的 CagA 蛋白，在免疫诊断和疫苗研究中具有重要作用。
   • 特异性：CagA 重组抗原与幽门螺旋杆菌感染患者血清中的抗体特异性结合能力强，通过免疫印迹等实验验证，与其他细菌抗原无明显交叉反应，特异性良好。
   • 稳定性：CagA 重组抗原在适当的缓冲液中，4℃可保存数周，-80℃可长期保存。在保存过程中，应避免蛋白溶液反复冻融和长时间暴露在室温下，以防蛋白变性和降解。

幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）抗原

1. 表达系统
   • 宿主细胞：多选择大肠杆菌或昆虫细胞表达系统。大肠杆菌表达系统操作简单、成本低，但对于 VacA 这种较为复杂的蛋白，可能需要优化表达条件以获得正确折叠的蛋白。昆虫细胞表达系统能进行更复杂的翻译后修饰，可产生具有天然构象和活性的 VacA 抗原。
   • 载体选择：针对大肠杆菌表达，可选用 pET - 28a 等载体，便于引入 His 标签进行纯化。对于昆虫细胞表达，常用杆状病毒表达载体，如 pFastBac 系列，能在昆虫细胞中高效表达外源蛋白。
2. 蛋白表达与纯化
   • 诱导条件：在大肠杆菌中，IPTG 诱导浓度一般为 0.1 - 0.6 mM，诱导时间 4 - 12 小时，诱导温度 16 - 25℃，低温诱导有助于减少包涵体形成，提高可溶性蛋白表达量。在昆虫细胞中，通过转染重组杆状病毒后，培养细胞 72 - 96 小时可收获表达的 VacA 抗原。
   • 表达量：经过优化，大肠杆菌中 VacA 重组抗原的表达量每升可达几十毫克。昆虫细胞表达系统的表达量相对较高，每升培养物中可获得数百毫克的 VacA 抗原。
   • 纯化方法：利用 His 标签进行亲和层析是常用的纯化方法，可使用镍柱进行纯化。对于从昆虫细胞中表达的 VacA 抗原，还可结合离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化，以去除杂质和未折叠的蛋白，最终获得纯度不低于 90% 的 VacA 重组抗原。
3. 抗原特性
   • 分子量：VacA 蛋白的分子量约为 88 - 95 kDa，其在 SDS - PAGE 电泳中的迁移率与理论分子量相符。不同菌株来源的 VacA 蛋白分子量可能略有差异，这与氨基酸序列的微小变化有关。
   • 免疫原性：VacA 抗原具有良好的免疫原性，能诱导机体产生特异性免疫反应。免疫动物后，可通过 ELISA 检测到较高滴度的抗体，一般抗体滴度可达 1:2000 以上。所产生的抗体能够识别天然 VacA 蛋白，对幽门螺旋杆菌感染的诊断和疫苗研发具有重要意义。
   • 特异性：VacA 重组抗原与幽门螺旋杆菌感染患者血清中的抗体具有高度特异性结合能力，通过免疫荧光、免疫印迹等实验证实，与其他细菌抗原的交叉反应极低，特异性良好。
   • 稳定性：VacA 重组抗原在 4℃下可稳定保存数周，-20℃或更低温度下可长期保存。为保持其稳定性，应避免频繁冻融和在高温、高湿度环境下存放。同时，在蛋白溶液中可添加适量的保护剂（如甘油、BSA 等），有助于维持蛋白的活性和稳定性。