蛋白从头测序：技术原理与方法概述

蛋白从头测序（De Novo Sequencing）是一种无需参考基因组或数据库，直接解析蛋白质一级结构（氨基酸序列）的技术。该方法对于研究未知蛋白、抗体药物开发、非模式生物的蛋白组学分析，以及蛋白翻译后修饰（PTMs）的研究具有重要意义。传统的蛋白质测序依赖于基因组数据或已知蛋白质数据库的比对，但在面对新物种、突变体或翻译后修饰（PTM）复杂的样本时，这一方法的局限性凸显。蛋白从头测序（De Novo Protein Sequencing）应运而生，它无需依赖先验序列信息，直接从质谱数据中推导氨基酸序列，成为探索未知蛋白质的利器。

 

一、蛋白从头测序的基本原理

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的线性分子，其功能和结构依赖于氨基酸序列。从头测序的核心任务是通过分析蛋白或肽段的质谱数据，推导出完整的氨基酸序列。由于没有参考数据库，从头测序需要通过精准的质谱解析氨基酸残基及其序列信息。

 

通常，蛋白从头测序依赖于质谱技术，尤其是串联质谱（Tandem Mass Spectrometry, MS/MS）。在MS/MS实验中，目标蛋白首先经酶解（通常使用胰蛋白酶、Lys-C或Asp-N等）或化学降解（如Edman降解）得到较短的肽段，这些肽段经质谱仪离子化后进入碎裂池，产生具有特定碎裂模式的子离子。基于这些碎裂离子信号，可以解析肽段的序列信息。

 

二、蛋白从头测序的常用方法与流程

蛋白从头测序通常包括以下几个关键步骤：

1、样品制备与酶切

目标蛋白经过纯化后，通常使用胰蛋白酶、胨酶等不同专一性的蛋白酶进行切割，生成适合分析的小肽段。

 

2、质谱数据采集

采用高分辨质谱仪（如Orbitrap、TOF、FTICR-MS等）进行一级和二级质谱分析，获取肽段的质量信息和裂解模式。

 

3、谱图解析与序列推导

借助先进的算法软件（如PEAKS、Novor等），对碎片离子图谱进行分析，根据离子对的质量差推导氨基酸序列。

 

4、序列拼接与验证

将不同肽段推测出的序列进行拼接，形成完整的蛋白序列，同时与已知数据库交叉比对，验证结果准确性。

 

三、蛋白从头测序的挑战与发展趋势

1、技术挑战

（1）复杂样本的测序难度：蛋白质混合物的复杂性增加了解析难度，尤其是存在高度同源的蛋白时。

（2）翻译后修饰的干扰：某些修饰可能影响碎裂模式，使得肽段的序列解析更加困难。

（3）数据分析的计算复杂度：高分辨率质谱数据庞大，需要高效的算法提高拼接准确度。

 

2、未来发展趋势

（1）更高分辨率的质谱仪：提升碎裂谱图的质量，提高氨基酸残基识别的精度。

（2）人工智能辅助分析：结合深度学习技术，提高从头测序算法的准确性和效率。

（3）多层级分离策略：结合多维液相色谱（LC）和纳流质谱（nanospray MS），提高低丰度蛋白的解析能力。、

 

在非模式生物研究中，基因组信息不完整或缺乏数据库，蛋白从头测序可用于直接鉴定新蛋白，并推进生物学功能研究。此外，单克隆抗体（mAb）是重要的生物治疗药物，其氨基酸序列直接影响其特异性和稳定性。从头测序可解析抗体轻链和重链的序列，为抗体工程优化和生物仿制药开发提供关键数据。同时，蛋白从头测序结合修饰特异性富集技术（如磷酸化蛋白富集、糖肽富集等），可以解析修饰位点和修饰模式，帮助理解蛋白功能。随着技术的迭代，蛋白从头测序有望与基因组学、结构生物学深度融合，推动生命科学进入“无数据库依赖”的新纪元。百泰派克生物科技作为专业的生物质谱多组学优质服务商，可为客户提供专业的蛋白从头测序服务。

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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