Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)

Cell Counting Kit-8(CCK-8 试剂盒)产品简介

Cell Counting Kit-8，简称 CCK-8(或 CCK8)试剂盒，是一种基于 WST-8(化学名：2-(2-甲氧基 -4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的 快速、高灵敏度检测试剂盒。其检测原理在于，在电子耦合试剂存在的情况下，检测试剂中的WST-8 化合物被活细胞内脱氢酶还原成具有水溶性的橙黄色甲臜化合物,该物质在450 nm 处有最大吸收峰。

甲臜量与活细胞数成正比，即细胞增殖越多越快，则颜色越深;细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同 样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品，和 MTT 或其它 MTT 类似产品如 XTT、MTS 等相比有明显的优点。 首先，MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的 formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解; 而 WST-8 和 XTT、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的，可 以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8 产生 的 formazan 比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 更易溶解。再次，WST-8 比 XTT 和 MTS 更加稳定，使实验结 果更加稳 定。另外，WST-8 和 MTT、XTT 等相比线性范围更宽，灵敏度更高。WST-8 和WST-1 相比，检 测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。

CCK-8 试剂盒中WST-8 对细胞无明显毒性，可以用于外源细胞因子等诱导的细胞增殖检测，以及药物 等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测，是 MTT 检测方法的升 级版。

CCK-8 试剂盒使用便捷，无需配制或稀释，无需收集或洗涤细胞，无需对甲臜化合物进行再次溶解， 对贴壁细胞及悬浮细胞均适用。且酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

Cell Counting Kit-8(CCK-8 试剂盒)使用说明

1.制作标准曲线(测定细胞具体数量)

(1)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

(2)按比例(例如：1/2 比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细 胞浓度梯度，每个浓度建议 3-6 个复孔。

(3)接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一 条以细胞数量为横坐标(X 轴)，OD 值为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出 未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以 及加入 CCK-8 后的培养时间。)

2.细胞活性检测

(1)在 96 孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5% CO2 )。

(2)向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数)。

(3)将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

(4)用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。

(5)若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并 遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

3.细胞增殖-毒性检测

(1)在 96 孔板中配制 100 μL 的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养 24 小时(37℃ , 5% CO2)。

(2)向培养板加入 10 μL 不同浓度的待测物质。

(3)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如：6、12、24 或 48 小时)。

(4)向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数)。

(5)将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

(6)用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。

(7)若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并 遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基(除去培养基， 并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况 下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

4.活力计算：

细胞活力(%) =[A(加药)-A(空白)]/ [ A(0 加药)-A(空白)]× 100

A(加药)：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0 加药)：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

注意事项

1.CCK-8 试剂盒检测原理是依赖于脱氢酶催化的反应，样品中如有较多还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰 检测，需设法去除。

2.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

3.白细胞可能需要培养较长时间。

4.当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1 ,000 个/孔 (100 µL 培养基)。检测白细 胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 ( 100 µL 培养基)。如果要使用 24 孔 板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。

5.如果没有 450 nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 检测灵 敏度最高。

6.培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造 成影响。

7.由于使用96 孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于 96 孔板 周围一圈 最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的 PBS、水或培养液;另一方面， 可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸 发。

8.加检测试剂时避免产生气泡，否则会干扰检测结果。

9.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放 于普通住宅内。

10.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。