GCMCs【Guinea pig ciliary muscl

细胞操作详细步骤----贴壁细胞

1.细胞复苏

1.1离心法

1.1.1准备一个T25的细胞培养瓶并做好标记，预热好的细胞完全培养基，一支15ml离心管，离心管中加入4-5ml细胞完全培养基。

1.1.2取出细胞冻存管，在37度水浴中快速解冻，将管子擦干并消毒后迅速拿回生物安全柜。

1.1.3将细胞悬液转移到加有培养基的离心管中，1000转离心5分钟。

1.1.4倒掉上清，加入培养基轻轻重悬细胞亦可先将细胞团弹散后加入培养基混匀。

1.1.5将重悬好的细胞转移到T25细胞培养瓶，补充培养基到8ml左右，十字摇晃，将细胞铺匀后放入培养箱培养。

1.2不离心法

1.2.1准备一个T25的细胞培养瓶并做好标记，预热好的细胞完全培养基，培养瓶中加入8ml左右培养基。

1.2.2取出细胞冻存管，在37度水浴中快速解冻，将管子擦干并消毒后迅速拿回生物安全柜。

1.2.3将细胞悬液转移到加有培养基的培养瓶中，十字摇晃，将细胞铺匀后放入培养箱培养，接种16小时后更换培养基。

2.细胞传代

2.1准备细胞完全培养基，细胞培养瓶，胰酶（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA），DPBS。

2.2弃上清，并加2-3mlDPBS轻柔冲洗培养瓶内细胞1-2次。

2.3加入1ml胰酶，室温或者37度消化，直到细胞成片脱落，加入3-4ml完全培养基终止消化，如果有成团块脱落的细胞可轻轻吹打分散细胞后再终止消化。（注意：消化时间与所用胰酶效价，消化时候细胞密度以及温度等因素有关，建议第一次消化时候，多在显微镜下观察，以找到最佳消化时间）

2.4收集细胞悬液，1000转离心5分钟，弃上清，加入培养基轻轻重悬细胞亦可先将细胞团弹散后加入培养基混匀。

2.5将重悬好的细胞按比例分装至T25细胞培养瓶，补充培养基到8ml左右，十字摇晃，将细胞铺匀后放入培养箱培养。

3.细胞冻存

3.1准备细胞冻存液，细胞冻存管，胰酶（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA），DPBS。

3.2弃上清，并加2-3mlDPBS轻柔冲洗培养瓶内细胞1-2次。

3.3加入1ml胰酶，室温或者37度消化，直到细胞成片脱落，加入完全培养基终止消化，如果有成团块脱落的细胞可轻轻吹打分散细胞后再终止消化。

3.4收集细胞悬液，1000转离心5分钟，弃上清。

3.5加入冻存液，重悬细胞，并分装到冻存管，冻存密度0.8-1.5×10⁶细胞/ml。

3.6将冻存管放入程序降温盒，并放到-80℃冰箱，过夜后将冻存管转移到液氮保存。

4.注意事项

4.1建议收到细胞后先用我们配套的培养基和血清。收到活细胞的客户培养瓶中的培养基可回收使用，保存在4度可使用一周。

4.2不同实验室操作上会有些许差异，为了避免细胞不适应，请先按照说明书推荐的方法和操作步骤培养，待细胞冻存后可根据自己的习惯操作看细胞是否能够适应。

4.3建议收到细胞后，前几代及时冻存一些细胞，并最好是可以多冻存几个批次。

收到货后处理方式： 1.细胞冻存管： 收到货物后，请检查箱子里面是否还有干冰。 ● 若干冰已剩余不多，不能掩埋冻存管，请及时拍照，并第一时间联系销售。 ● 若干冰充裕，可以安排复苏细胞，复苏方法参考【说明书】；不安排复苏，请将细胞冻存管转移到液氮进行保存。短期（一周内）的存放可以放在-80冰箱，建议最好保存在液氮中。 2.培养瓶的活细胞： 收到请检查培养瓶是否完好，是否有漏液，培养基是否浑浊 ●若出现以上问题请于当天和我们销售取得联系，我们会第一时间为您处理。 ● 若以上问题都没有出现:拆掉培养瓶的外包装，在显微镜下对细胞进行多个视野，不同倍镜拍照。然后用酒精对瓶身进行彻底消毒，放在37度二氧化碳培养箱中进行复温。1-2小时后，拿出在显微镜下观察，并进行多个视野不同倍镜拍照。若细胞达到了可以传代的密度，请按照【说明书】的传代方法进行操作。若细胞密度不能进行传代，请回收培养瓶中的培养基，留适量培养基在瓶中，并将培养瓶放在培养箱继续培养即可（个别细胞除外，详见说明书）
仅供研究之用