大鼠肝实质细胞分离试剂盒

大鼠肝实质细胞分离试剂盒产品描述

Cat NO: IMP-RK001

肝实质细胞是肝功能的基本组成单位，大约占肝脏体积及数量的 80%左右，肝实质细胞具有多方 面的功能，例如：蛋白质的合成和储存、分泌胆汁和解毒物质等。体外培养的肝实质细胞是研究肝脏 能量代谢、物质合成、药理毒性学良好模型。试剂盒采用二步灌流法，使得原代肝实质细胞从在体肝 脏中消化，结合细胞纯化液使用可快速纯化得到大鼠肝实质细胞。使用本试剂盒提取所得的大鼠肝原 代实质细胞纯度>90.0%，纯化后可直接进行 RT-qPCR、Western blot等基本生物学实验，贴壁后可进行 药理、病理、毒理学、免疫染色等实验操作。

大鼠肝实质细胞分离试剂盒适用范围

该试剂盒适用于 Sprague-Dawley、Wistar-Imamichi 等不同型号 5~6 周龄大鼠的原代肝实质细胞提 取试剂盒。

大鼠肝实质细胞分离试剂盒运输和存储条件

2-8 ℃保存与运输，保质期为参考下表。所有组分开封后，有效期为 6-8 周，建议尽快使用。

大鼠肝实质细胞分离试剂盒配套培养基信息

表 1. 试剂盒组成信息

产品货号	产品名称	产品规格	储存条件
IMP-RK001B	大鼠肝实质灌注液 Ⅰ	500 mL	2-8°C 3  个月
IMP-RK001C	大鼠肝实质灌注液 Ⅱ	250 mL	2-8°C 3  个月
IMP-RK001Q	细胞洗液	500 mL	2-8°C 3  个月
IMP-RK001D	活细胞纯化分离液	50 mL	2-8°C 6  个月
IMP-RK001E	活细胞纯化分离稀释液	100 mL	2-8°C 6  个月

IMP-RK001A	Ⅰ 型鼠尾胶原蛋白	20 mL	2-8°C 3  个月
IMP-RK00101	肝实质贴壁培养基	100 mL	2-8°C 3  个月
IMP-RK00102	肝实质维持培养基	250 mL	2-8°C 3  个月

分离步骤

实验前准备：将大鼠肝实质灌注液 Ⅰ 、灌注液Ⅱ置于水浴锅中加热至37℃ , 备用。实验需自备注 射器、静脉留置针/静脉输液针、手术器械、100 μm 过滤筛、离心管若干。

一、实验前准备

1.肝实质细胞种板前预先用 Ⅰ 型鼠尾胶原蛋白(以下简称鼠尾胶)铺至培养器皿底部包被0.5-2h

(最长不超过6 h)，吸尽鼠尾胶，鼠尾胶可回收使用 1-2 次。

2.使用 1 ×PBS 清洗皿底后吸去 PBS ，待用。

二、肝脏灌注

1.麻醉并且固定大鼠，酒精喷洒清洗腹部。

2.剪开大鼠腹腔，沿肝脏上方剪开胸腔隔膜，使上腔静脉暴露，用止血钳夹住上腔静脉。

3.拨开大鼠肠组织，暴露大鼠下腔静脉和肝门静脉，在下腔静脉的位置插入静脉留置针/静脉输液 针并固定好位置(使用留置针则轻轻拔出针芯，拔出时针管处有回血，此时外套软管留在血管内)进 行灌注。

4.将装有肝实质灌注液 Ⅰ 的注射器与针的另一头相连接，保持灌流速度在 30 mL/min ，灌注液 I 灌入后可见肝脏充盈，此时剪开门静脉引流，直至肝脏表面血丝较少或无血色，绝大部分肝组织表面 呈现蜡黄色为止。

5.换上肝细胞灌注液 Ⅱ , 流速改为 10 mL/min 进行灌流，并节律性挤压门静脉切口(挤压5-10s 左右，间隔 30s-1min,让肝脏充盈，提高消化率)，持续消化 15-25min 不等，消化肝脏直至用棉签按压 肝脏有明显塌陷感，且回弹速度变慢。

6.将肝脏沿着膈肌周围整个剪下来，转移到一个装有预冷后的细胞洗液的培养皿中。在超净台中 用镊子去除胆囊和肝脏外的包膜，轻轻抖动组织使肝实质细胞如流沙状流出，未完全分散的部分用镊 子轻轻拨散至细胞洗液中。

三、肝实质分离纯化

1.用细胞洗液润洗 100 μm 筛网，将上述步骤中的培养皿内的细胞浊液用宽头吸头或者巴氏管移 至筛网上方过滤。

2.4℃、50 xg 离心 5 分钟。

3.小心弃去上清(低速离心后，肝实质细胞以松散的方式沉在底部，弃上清时切勿吸力过大或者 直接倾倒上清)，加入 15 mL 细胞洗液，用宽头吸头或者巴氏管轻轻重悬沉淀。

4.重复步骤2 ，小心弃去上清，加入细胞洗液重悬细胞沉淀。

5.依据细胞活率和数量配置 30%-50%的活细胞纯化液(纯化液浓度越高，得到的肝实质细胞活性 越好，但与此同时，得到的细胞数量会减少，需要依据实验进行取舍，如配置30% 细胞纯化液配方为： 细胞纯化液：分离纯化稀释液 = 3:7)。将细胞悬液小心添加至两倍体积的细胞纯化液面上，细胞悬液 与细胞纯化液间应产生明显分层。

6.400 x g 、4 ℃离心 10 分钟(使用水平转子，加速度减速度均为最低)。

7.离心完毕后离心管底部的沉淀即为纯化后的肝实质细胞，用贴壁培养基重悬。

四、肝实质细胞培养

1.将细胞悬液按照3 x 105/mL 细胞密度铺至鼠尾胶包被的培养器皿中，转移至细胞培养箱 中。

2.4 h 后显微镜下观察，肝实质细胞呈较大圆形、有明显双核结构，将培养器皿内的贴壁 培养基更换为维持培养基。

注意事项

1.肝脏离体后建议在冰上操作，分散肝实质细胞时应避免使用尖头吸头、过度重悬等操作导致细胞 机械损伤。

2.大鼠肝脏较大，如分散出来细胞较多，但还有较多肝组织未分散，可以将该部分肝组织转移至 1-2 个新的装有预冷细胞洗液的培养皿中进行进一步分散。

3.大鼠肝脏肝包膜要尽可能完全去除，否则有杂细胞干扰，影响细胞纯度。

4. 由于大鼠肝脏能够分离出较多肝实质细胞，进行细胞纯化步骤时可以多配置几管活细胞纯化液 进行使用，避免纯化效果差。

5.肝实质细胞在贴壁2-3 天后分化明显，建议在3 天内完成实验。

6.肝实质细胞为不可传代细胞，禁止使用胰酶等消化酶处理肝实质细胞。

7.小鼠肝实质灌注液 Ⅱ 中含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需 要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染