小鼠结肠类器官完全培养基

小鼠结肠类器官完全培养基产品描述

Cat NO: IMV-NM19

小鼠结肠类器官培养基套装(Mouse Colonic Organoid Medium Set)是一款用于扩增和分化小鼠结肠类器官的完全培养基。扩增时的小鼠结肠类器官主要由结肠干细胞和结肠祖细胞组成，分化后的小鼠结肠类器官由结肠吸收细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成。结肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内结肠上皮的特征，因此是小鼠结肠研究的理想体外模型。

小鼠结肠类器官完全培养基产品信息

表1. 培养基组成信息

小鼠结肠类器官完全培养基使用说明

1. 收到类器官培养基后，将培养基置于四度冰箱进行解冻;

2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在无菌的生物安全柜或超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格;

3.将分装后的培养基储存于-20℃，使用时拿出分装后的培养基解冻后即可使用。

注意：

l 分装后的类器官培养基需储存于-20℃，有效期两年，注意避免反复冻融;

l 解冻后类器官完全培养基可在 4°C 储存，建议在两周内使用;

l 类器官培养基中内含有细菌及真菌抗生素。

小鼠结肠类器官的建立与传代培养

原代小鼠结肠类器官的建立

1.取样：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近盲肠端3~5cm结肠组织，用镊子去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含双抗的DPBS溶液中。

2.清洗：使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面粘液或残留的粪便，接着将结肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗。 将清洗后的肠组织剪碎至2-5mm宽，随后转移至50ml离心管中，剧烈震荡30s(垂直上下震荡90 次一上一下算一次，约 1s 三次) 弃上清，重复3次。

3.消化：加入30 mL的DPBS 溶液中再加入150 μL 0.5M EDTA，至EDTA终浓度为2.5mM。置4℃摇床上，80rpm，消化 60 min。

4.清洗：消化完成后，静置待肠段沉淀，弃上清。加入预冷DPBS，轻柔摇匀，静置后弃上清，重复2次以去除EDTA。

5.重悬：加入30 mL预冷的含1%FBS的DPBS，涡旋 30s，取上清70μm滤网过滤，收集穿过滤网的组织悬液，记为馏分1。重复收集2次，记为馏分2和馏分3。

6.收集：300g 离心力 4℃离心3min。

7.计数：弃上清，根据沉淀量使用 DPBS重悬组织沉淀，取20μL 悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g 离心力 4℃离心3min，弃上清后置于冰上。

8.用适量的基质胶重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10μL 基质胶悬液包含 100 至 200 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

9.将基质胶和组织细胞的混合悬液点入24孔板底部正中央，每孔30 μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

10.将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30 min左右待基质胶凝固。

11.待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠结肠类器官完全培养基，24孔板每孔500μL，避免破坏已凝固结构。

12.将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养。

13.每 2~3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏基质胶。密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠结肠类器官应在5至7天内建成。

小鼠结肠类器官的传代培养

1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将结肠类器官和培养基悬液转移至经过润洗液润洗的 1.5 mL EP 管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，多次吹打使得类器官与基质胶分离。

3. 300×g，4℃离心 3 min，弃上清，用经过润洗液润洗的枪头加入 200 μL 类器官消化液并充分混匀，37℃条件下消化 1- 3 min，消化结束后加入 1 mL 上皮类器官基础培养基吹打混匀。

4. 300×g，4℃离心 3 min，弃上清，再次加入 1 mL 上皮类器官基础培养基并混匀。

5. 300×g，4℃再次离心 3min，弃上清后置于冰上。

6. 用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30 μL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 30 min 左右待基质胶凝固后取出。

9. 待基质胶完全凝固后，沿孔壁加入提前预热的小鼠结肠类器官完全培养基，24孔板每孔 500 μL。

10. 将24孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。