hPSC诱导分化运动神经元细胞试剂盒

hPSC 诱导分化运动神经元试剂盒产品描述

本产品为人多能干细胞向运动神经元诱导分化试剂盒，可用于分化获得的运动神经元能表达运动 神经元的特异性标志物(如 CHAT 等)，适用于体外研究。

本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对神经元培养具有一定了解。

以六孔板为例，本产品提供的规格可供两个孔的 hPSC 诱导分化，最终可获得 6 个孔的成熟运动神 经元(约 1.2×107 个细胞)，以及可供运动神经元祖细胞扩增一代(六孔板 1 孔传 6 孔)。

本产品分化流程图

hPSC：人多能干细胞;NPC：神经祖细胞;MNP：运动神经元前体细胞;MN：运动神经元;

mMN：成熟运动神经元

hPSC 诱导分化运动神经元试剂盒产品信息

表 1. 试剂盒组成信息

产品货号	产品名称	产品规格	储存
IMI-MN01BM1	基础培养基 1	110 mL	2℃-8℃ , 12 个月
IMI-MN01BM2	基础培养基2	150 mL	2℃-8℃ , 12 个月
IMI-MN01A	补充剂 A（250×)	80   μL	-20℃ , 6 个月
IMI-MN01B	补充剂 B（250×)	160   μL	-20℃ , 6 个月
IMI-MN01C	补充剂 C (62.5×)	1.8 mL	-20℃ , 12 个月
IMI-MN01D	补充剂 D（2000×)	20   μL	-20℃ , 6 个月
IMI-MN01E	补充剂 E（50×)	3 mL	-20℃ , 6 个月

 

注：括号内容如 250×为母液浓度，使用时终浓度需为 1 × 。例如补充剂 A(250×) 和补充剂 C (62.5×)需 添加进基础培养基 1 使其分别稀释 250 倍以及 62.5 倍，使得补充剂终浓度为 1 × , 配成 NPC 诱导培养基。

实验试剂与材料

表 2. 推荐试剂&材料

试剂&材料	品牌（e g ）	货号（e g ）
hESC/iPSC 细胞培养试剂盒	逸漠生物	IMC-014
hESC（H1）	逸漠生物	IM-H522
hESC/iPSC 传代工作液	逸漠生物	IMC-014-E
Y-27632	逸漠生物	IMC-014-Y
DMEM/F12 培养基	逸漠生物	IMC-205
Matrigel	Corning	354277
Accutase	STEMCELL	07920
无血清细胞冻存液	逸漠生物	IMC-701
PBS	逸漠生物	IMC-401
6 孔细胞培养板	硕华生物	N/A
15 mL/50 mL 离心管	硕华生物	N/A
10   μL/200   μL/1000   μL 无菌吸头	佳顺生物	N/A
10mL/50mL 移液管	NEST	N/A

 

实验内容与方法(以hESC H1 及 6 孔板 1 个孔为例)

一、试剂准备

表 3. 各阶段培养基成分

研究阶段	培养基名称	各阶段培养基组成
神经祖细胞(NPC)阶段	NPC 诱导培养基	基础培养基 1
		补充剂 A（1× )
		补充剂 C（1× )
运动神经元祖细胞(MMP)阶段	MNP 诱导培养基	基础培养基 1
		补充剂 B（1× )
		补充剂 C（1× )
运动神经元(MN)阶段	MN 诱导培养基	基础培养基2
		补充剂 D（1× )
		补充剂 E（1× )
运动神经元成熟	MN 成熟培养基	基础培养基2
		补充剂 E（1× )
运动神经元祖细胞扩增	MNP 扩增培养基	基础培养基 1
		补充剂 F（1× )
		补充剂 C（1× )

(1) 在 4℃解冻 补充剂 A 、B 、C 、D 、E 、F ，不要在 37℃条件下解冻。

(2) 在生物安全柜中，参考表 1 及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶 段培养基 。例如 NPC 诱导培养基组成为基础培养基 1 、1×浓度的补充剂 A 和 1×浓度的补充剂 C ，若用量为20mL ，配制方法为 19600 μL 基础培养基 1+80 μL 补充剂 A(250×) +320 μL 补充 剂 C(62.5×) 。

(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：补充剂 B 、D 、F 使用时尽量避光，且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、hESC 培养和准备(详见 hESC/iPSC 细胞培养试剂盒使用说明书)

三、DAY 0-6: hESC 分化为神经祖细胞(NPC)

(1) 基质胶在 4℃下解冻，与 DMEM/F 12 均匀混合(基质胶:DMEM/F12=1:100)，铺板，备 用。

(2) DAY -1: 当 hESC 的汇合度达到 75%-85% ，吸去培养基，用 2mL 1x 室温 PBS(不含 Ca2+/Mg2+)清洗 hESC ，吸去 PBS。

(3) 加入 1mL 含 Y-27632(10 μM)的室温 Accutase ，转移到 37℃ 5% CO2 细胞培养箱中 3-5min ，使其解离成单细胞。

(4) 3-5min 后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入 Accutase 中，并使用P-1000 吸头轻轻 上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到 15mL 离心管中，室温下 300g 离心 5 min。

(5) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(6) 离心结束，充分去除上清，将 1 mL 预热的hESC/iPSC 完全培养基(含 10μMY-27632)

重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。

(7) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到步骤 1 制备的6 孔基质胶包被的板上使得最终密度为 3.0 × 104 个细胞/cm2，在 6 孔板中每孔最终体积为 2mL(含 10 μMY-27632)，将孔板转移到 37℃、5%CO2 细胞培养箱中孵育24h。

(8) DAY 0: 24h 后吸去培养基，并加入 2mL NPC 诱导培养基(成分为：基础培养基 1 ，1×补 充剂 A ，1×补充剂 C)。

(9) 隔天使用 NPC 诱导培养基换液，直到第6 天。

(10) 可取第 6 天的细胞进行免疫荧光染色检测 NPC 标志物如 SOX2 、SOX1 、Nestin。

注：基质胶使用时需在冰上操作，所有与基质胶直接接触的物品需提前预冷，基质胶超过 10℃将迅速凝固， 导致铺板失败。

四、DAY 6-12: NPC 诱导分化为运动神经元祖细胞(MNP)

(1) DAY 6： 第 6 天，从培养物中抽吸培养基，在 6 孔板中每孔用2 mL 1×室温 PBS(不含 Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除 PBS。

(2) 加入 1mL 含 Y-27632(10 μM)的室温 Accutase ，转移到 37℃ 5% CO2 细胞培养箱中 3-5min ，使其解离成单细胞。

(3) 3-5min 后，将 DMEM/F 12(含 10 μMY-27632)以等体积直接加入 Accutase 中，并使用 P-1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到 15mL 离心管中，室温下

300 g 离心 5 min。

(4) 从基质胶包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏基质胶涂层表面。

(5) 离心结束，充分去除上清，将 6mL 预热的 MNP 诱导培养基(成分为：基础培养基 1 ，1 ×补充剂 B ，1×补充剂C)(含 10μMY-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液 均匀。按 1:3 比例接种在基质胶包被的板中，每孔加入 2mL 细胞悬液于37℃、5%CO2 细胞培养 箱培养 24h 。

(6) DAY 7: 第 7 天开始隔天更换一次 MNP 诱导培养基，直到第 12 天。

(7) 可取第 12 天的细胞进行免疫荧光染色检测 MNP 标志物 Olig2。

注：MNP 可用常规冷冻培养基(DMEM/F 12 、10%胎牛血清和 10% DMSO)或逸漠生物无血清细胞冻存液(推 荐使用)在液氮中冷冻，解冻后可在 MNP 扩增培养基中再次培养，培养方法见补充部分。

五、DAY 12-18: MNP 诱导分化为运动神经元(MN)

(1) DAY 12: 第 12 天，从培养物中抽吸培养基，在 6 孔板中每孔用2 mL1×室温 PBS(不含 Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去 PBS。

(2) 每孔加入 1mL 含 Y-27632(10 μM)的室温 Accutase ，将培养物置于 37℃ 5%CO2 细胞 培养箱中孵育 3-5 min。

(3) 3-5min 后每孔加入 1mL DMEM/F12(含 10 μMY-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞脱离 孔底。

(4) 将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中，室温下 300g 离心 5 min。

(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用 1mL 恢复室温的 MN 诱导培养基(成分为：基础培养 基 2 ，1×补充剂 D ，1×补充剂E)(含 10 μMY-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细

胞溶液均匀。

(6) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到提前制备的基质 胶包被的 6 孔板上使得密度为 5.0 ×104 个细胞/cm2。

(7) DAY 13: 更换为不含Y-27632 的 MN 诱导培养基。每隔一天更换培养基，直到第 18 天。

(8) 第 18 天可检测到神经元标志物(TuJ1)， 运动神经元标志物(PHOX2B 、PRPH、ISL1、 ISL2)的表达

注：Motor Neuron 贴壁较松，换液时要特别轻柔。

六、DAY 18-28: MN 成熟阶段

(1) DAY 18: 第 18 天，吸去培养基，每孔加入 2mL MN 成熟培养基(成分为：基础培养基 2， 1×补充剂 E)。

(2) 隔天换液，直到第28 天获得成熟 MN(mMN)。

(3) mMN 可用MN 成熟培养基继续维持培养。

(4) 这一阶段可检测到 CHAT 的表达。

注：Motor Neuron 贴壁较松，换液时要特别轻柔。

补充:DAY 12: MNP 扩增

第 12 天获得的 MNP 可扩增至少 5 代，5 代内可维持 Olig2 高表达。

扩增方法如下：

(1)DAY 12: 第 12 天，从培养物中抽吸培养基，在 6 孔板中每孔用2 mL1×室温 PBS(不含 Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去 PBS。

(2)每孔加入 1mL 含 Y-27632(10 μM)的室温 Accutase，将培养物置于 37℃ 5%CO2 细胞 培养箱中孵育 3-5 min。

(3) 3-5min 后每孔加入 1mL DMEM/F12(含 10μMY-27632)，轻轻吹打细胞，使细胞脱 离孔底。

(4)将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中，室温下 300g 离心 5 min。

(5)仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用 1mL 恢复室温的 MNP 扩增培养基(成分为：基础培 养基 1 ，1×补充剂 C ，1×补充剂F)(含 10μMY-27632)重悬细胞，轻轻地上下移液以确 保单细胞溶液均匀。

(6)按 1:6 比例接种在基质胶包被的板中，每孔加入 2mL 细胞悬液于37℃、5%CO2 细胞培 养箱培养24h 。

(7)第 2 天更换不含Y-27632 的 MNP 扩增培养基。每周可传一次代。