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文献和实验感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。 (2)服务流程 1)含目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取; 2)慢病毒干扰载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞; 3)培养48~72h,收集培养上清; 4)病毒的纯化和浓缩(超离和/或超滤); 5)滴度测定、目的基因检定 6)将制得的慢病毒液转导客户的靶细胞,筛选混合稳定细胞株,并检测靶基因的表达。 客户提供 1)表达miRNA/shRNA的质粒(提供测序图谱)或所要
感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。 (2)服务流程 1)含目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取; 2)慢病毒干扰载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞; 3)培养48~72h,收集培养上清; 4)病毒的纯化和浓缩(超离和/或超滤); 5)滴度测定、目的基因检定 6)将制得的慢病毒液转导客户的靶细胞,筛选混合稳定细胞株,并检测靶基因的表达。 客户提供 1)表达miRNA/shRNA的质粒(提供测序图谱)或所要
NaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。 6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。 7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。 8)吸去上清,加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽
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