pIRES-puro2质粒

【原创】表达载体的选择及构建方法

型质粒 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核

细胞转染后抗生素选择

表达都要根据载体的说明选择相应抗生素，不是可以随便用的。做细胞表达时，如果只是要求短时表达（即所谓瞬时转染），可不必用细胞抗生素。丁香园网友mikke_2000认为：应该是质粒转染细胞，筛选出稳定表达新基因的细胞系吧。筛选所选用的抗生素是跟你转染所用的质粒上所带的真核筛选抗性基因有关的。最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo，所以筛选的时候用G418，如果带有嘌呤霉素的抗性基因就要选用puro。另外如果双转染，要考虑到两种质粒的筛选抗性的兼容。G418等的筛选浓度最好也用预试验摸一下~~

CRISPR 技术进行细胞 TP53 基因敲除

EGFP 荧光表达。 检测结果显示靶点一和靶点二均有效果，靶点一的效果优于靶点二。 TP53 基因敲除 293T 细胞筛选 实验步骤 1) 转染前 24 小时将 293T 铺到 6 孔板中。 2) 按照下列体系制备质粒稀释液 pCas9/gRNA1-P531 0.7ug pLV-EGFP（2A）puro 0.1ug DMEM 培养基 X ul 总体积 50ul 3) 准备转染