ROX reference dye for qPCR, 50

qPCR常见问题及其分析

MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测

没有 CT 值，我的 QPCR 实验失败了吗？（下）

「Undetermined」（图 11A），但看多组分图时发现报告荧光有正常的扩增曲线，而 ROX 的荧光值却在 0 的位置（图 11B）。显然，这是使用了一种不含 ROX 的试剂，但未取消 ROX 分析导致的。这个数据只要在分析设置中将 Passive reference dye 从默认的 ROX 改成 None，再重新分析就可以得到正常的结果。 图 11 未加 ROX 导致扩增曲线异常 案例 8： 再来看一个相对少见一点的案例。在这个案例里，也是只有杂乱的扩增曲线，无法获得 CT 值（图 12A）。而查看多组分图

Real-time qPCR 手册——手把手教你从菜鸟到高手

、Real-time qPCR 实验设计 实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。对于一个 real-time qPCR 而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。 1. 实验材料的处理和准备 以最基本的基因