乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(WST-8法)

碧云天的乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(WST-8法) (LDH Release Assay Kit with WST-8)，也称乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) (LDH Assay Kit with WST-8)、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(WST-8法) (LDH Cytotoxicity Assay Kit with WST-8)或乳酸脱氢酶活性检测试剂盒(WST-8法) (LDH Activity Assay Kit with WST-8)，是一种基于WST-8的显色反应，通过比色法快速、高灵敏地检测细胞坏死(Necrosis)等细胞膜完整性受损时释放的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活性或检测其它样品中的LDH活性的试剂盒。

本试剂盒用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测，也可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测。

LDH是绝大部分哺乳动物活细胞中都存在的酶，广泛存在于哺乳动物各个组织中，以心、骨骼肌和肾脏通常最为丰富，是临床心肌酶谱检查中的一项重要指标，可用于心肌疾病的辅助诊断。LDH催化乳酸(Lactate)生成丙 酮酸(Pyruvate)，同时伴随着NAD+到NADH的转化。由于其常在组织损伤期间释放(通常因为细胞膜失去完整性而导致细胞内LDH的释放)，因此也被视作细胞坏死和常见损伤和相关疾病的生物标志物[1, 2]。

细胞死亡包括凋亡(Apoptosis)、坏死(Necrosis)、焦亡(Pyroptosis)等多种形式。其中受调控的细胞死亡被称为程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD)，而不受调控的细胞死亡被称为坏死。细胞坏死(Necrosis)或者细胞凋亡(Apoptosis)的继发性坏死(Secondary necrosis)、焦亡(Pyroptosis)等造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞内的酶释放至细胞外，其中包括酶活性较为稳定的LDH。如果是培养的细胞就会释放到培养液里；如果是活体动物就会释放到组织微环境并很可能进入血液。对于培养的细胞，通过检测从质膜破裂的细胞中释放出来的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。LDH释放被认为是细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞坏死等细胞膜完整性受损的检测。LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法[3]。

LDH活性有多种比色测定方法如DNP法、INT法、WST-8法等。DNP法即2,4-二硝 基苯 肼法，其原理是LDH催化乳酸生成丙 酮酸，丙 酮酸和2,4-二硝 基苯 肼(2,4-dinitrophenylhydrazine)反应，生成二硝 基苯腙(2,4-dinitrophenylhydrazone)，在碱性溶液中呈棕红色，其颜色深浅与LDH量成正比。DNP法步骤较为繁琐，一般较为少用。INT法，如碧云天乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(C0016/C0017)，是基于在LDH的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(Formazan)。

本试剂盒采用的是WST-8法，和INT法相比，通常检测灵敏度更高，吸光度变化更大，检测结果更准确。

本试剂盒既可以检测D-LDH，也可以检测L-LDH，或两者的混合物。

本试剂盒的基本原理如下。在LDH的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和WST-8反应生成NAD+和水溶性的甲臜染料(Formazan dye)，在450nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量LDH的活性。吸光度与LDH活性成线性正相关。该酶联反应原理的示意图如下(图1)。

图1.碧云天乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(WST-8法) (C0019)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽。在样品体积为100μl时，可检测活力低至0.15mU/ml的乳酸脱氢酶，在0.15-50mU/ml活力范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了乳酸脱氢酶标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，计算出样品中的乳酸脱氢酶的活性。

图2.碧云天乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(WST-8法) (C0019)对乳酸脱氢酶标准品的检测效果图。各浓度的LDH标准品加入LDH检测工作液后，37ºC孵育30分钟，测定A450，在0.15-50mU/ml范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因检测仪器、实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中LDH的活性。

按照使用说明推荐的使用量进行检测，本产品小包装可进行100次检测，中包装可进行500次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C0019S-1	LDH Release Assay Buffer	10ml
C0019S-2	Chromogen Solution	1ml
C0019S-3	Lactate Dehydrogenase (2.5U/ml)	50μl
C0019S-4	Stop Solution	2.2ml
－	说明书	1份

 

产品编号	产品名称	包装
C0019M-1	LDH Release Assay Buffer	50ml
C0019M-2	Chromogen Solution	5ml
C0019M-3	Lactate Dehydrogenase (2.5U/ml)	250μl
C0019M-4	Stop Solution	12ml
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。Chromogen Solution须避光保存。试剂盒解冻后可以短期4ºC存放，2-3天内有效。

注意事项：

冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活，样品在4ºC可放置2-3天。建议样品准备好后尽量当天完成测定。

LDH Release Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它溶液使用时应在冰上进行。

在检测细胞培养液中的乳酸脱氢酶时，由于血清含有乳酸脱氢酶，使用含血清的培养液会增加背景读数，在检测时一定要设置没有细胞，但加入了相同体积培养液的对照孔，以用于消除背景。血清含量越高，背景值越高。如果对于实验无明显影响，建议使用灭活血清，这样血清中的乳酸脱氢酶会被很大程度上失活，大幅降低背景。如果对于实验无明显影响，实验时可以使用无血清培养液或血清浓度较低的培养液，这样能有效降低血清中乳酸脱氢酶的本底活性。

细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。此外，不同的细胞乳酸脱氢酶的含量也存在一定差异。

未加终止液时，随着时间延长，吸光值会逐渐增大。加入终止液后，显色可以稳定保存48小时。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。