Active Ras Pull-down and Detec

碧云天生产的Active Ras Pull-down and Detection Kit，也称活性Ras沉淀与检测试剂盒，是一种便捷、高效的用于定量检测组织或细胞裂解液中激活状态(Active state) Ras蛋白(包括NRas、HRas和KRas)的试剂盒。本试剂盒基于Raf1-RBD Agarose (活性Ras结合琼脂糖凝胶)特异性地结合沉淀(Pull-down)激活状态的Ras蛋白，通过Western检测Ras蛋白的激活水平(图1)。

图1. 碧云天Active Ras Pull-down and Detection Kit (P2433)的Pull-down工作原理图。洗脱产物后续可以用于Western检测。

Raf1是与Ras蛋白(包括NRas、HRas和KRas)相互作用的一种下游效应蛋白(Effector protein)，在细胞增殖、分化、凋亡、存活和致癌转化中起重要作用。Raf1全长648个氨基酸，理论分子量为73kDa，含有4个结构域：激活状态Ras的结合结构域(Active Ras-binding domain, RBD)、半胱氨酸富含区结构域(Cysteine-rich domain, CRD)、参与Raf1激活的抑制性磷酸化位点和激酶结构域。Raf1的RBD结构域可以特异性的识别并结合激活状态的Ras蛋白，但不结合静息状态的Ras蛋白，因此Raf1-RBD重组蛋白可用于检测激活状态的Ras蛋白，在体内或体外也可以作为Ras蛋白的抑制剂使用[1]。

小GTP酶(Small GTPase)，也称Small G-proteins、Ras superfamily，是调节真核细胞信号转导、细胞增殖、细胞骨架重组和细胞内膜转运等过程的分子开关，小GTP酶通过结合和水解GTP，在“激活”和“静息”状态之间循环：在外界信号的刺激下，鸟苷酸交换因子(Guanine nucleotide-exchange factors, GEFs)辅助小GTP酶将结合的GDP置换为GTP，小GTP酶结合GTP进入激活状态(Active state)；激活状态的小GTP酶与下游效应蛋白(Effector protein)相互作用，从而刺激细胞发生相应的响应；GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins, GAPs)催化小GTP酶结合的GTP水解为GDP，并释放自由磷酸盐(Free phosphate, Pi)，此时小GTP酶结合GDP进入静息状态(Inactive state)，鸟嘌呤核苷酸解离抑制蛋白(Guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDIs)抑制小GTP酶释放GDP，直到GEFs受到刺激信号再次开启新一轮的循环(图2) [2-3]。

图2. 小GTP酶在“激活”和“静息”状态之间循环的原理图。

小GTP酶在人类中已发现超过150个家族成员，在果蝇(Drosophila)、秀丽隐杆线虫(C. elegans)、酿酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、黏菌(Dictyostelium)和植物中也都发现了保守的同源物。小GTP酶根据结构和功能被分为5个家族分支：Ras家族、Rho家族、Ran家族、Rab家族和Arf家族。Ras家族本身又被分为6个亚家族：Ras亚家族、Ral亚家族、Rit亚家族、Rap亚家族、Rheb亚家族和Rad亚家族[4]。

Ras家族(Ras homologous GTPases)是调节肌动蛋白重组的关键因子，因此在肌动蛋白细胞骨架完整性、细胞增殖、细胞分化、细胞粘附、细胞凋亡和细胞迁移等细胞过程中发挥着重要作用。目前有16个成员被发现，被分为6个亚家族(见下表)，其中NRas、HRas和KRas研究的最为广泛[5]。

本试剂盒检测NIH 3T3细胞内源性激活状态Ras蛋白的效果见图3。实验采用GppNHp (鸟苷酰亚胺二磷酸锂)作为GTP替代物，GppNHp与GTPγS类似，都是一种不可水解的GTP类似物[6]。

图3. 碧云天Active Ras Pull-down and Detection Kit (P2433)用于检测NIH 3T3细胞内源性激活状态Ras蛋白的效果图。NIH3T3细胞裂解液分别加入终浓度为1mM GppNHp或GDP使Ras蛋白处于激活状态(Active state)或静息状态(Inactive state)，随后加入50μl Raf1-RBD Agarose，置于旋转混合仪上，4ºC孵育2小时。后经离心、洗涤，再加入1X SDS-PAGE上样缓冲液95ºC加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳后进行Western检测，使用Ras Rabbit Monoclonal Antibody孵育。Western印迹成像使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统完成(EI600)。Control为2ng Recombinant Human NRas (泳道1)，Input为NIH 3T3细胞裂解液(泳道2)。本试剂盒可特异性地结合并Pull-down激活状态的Ras蛋白(Ras-GppNHp) (泳道3)，但不结合静息状态的Ras蛋白(Ras-GDP) (泳道4)。“-”为NIH 3T3细胞天然存在激活状态的Ras蛋白(泳道5)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

Raf1-RBD Agarose储存溶液: 50mM HEPES (pH7.4), 150mM NaCl, 5mM MgCl₂, 0.5% Triton X-100, 1mM DTT, 10% glycerol.

按照单次使用20μl Raf1-RBD Agarose计算，本产品的小包装和中包装分别用于50次和250次实验。

包装清单：

保存条件：

-80ºC保存，一年有效。除Raf1-RBD Agarose外，-20ºC保存，一年有效。

注意事项：

Raf1-RBD Agarose到货后推荐-80ºC冻存，冻融两次有效，避免反复冻融，第一次使用可适当分装。其余试剂可以-20ºC冻存。

本试剂盒的使用次数按照单次使用20μl或50μl Raf1-RBD Agarose来设置。当使用不同量Raf1-RBD Agarose时，其它试剂用量也可相应按比例进行调整。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。