Amplex Red丙 酮酸检测试剂盒

碧云天研发的Amplex Red丙 酮酸检测试剂盒(Amplex Red Pyruvate Assay Kit)是一种基于探针Amplex Red，利用荧光或吸光度检测，快速、高灵敏地对血清、血浆、尿液等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清样品中丙 酮酸与丙 酮酸盐含量进行检测的试剂盒。通常0.2-2µl血清或血浆样品就足够用于本试剂盒的荧光法检测。

丙 酮酸(Pyruvic acid)，原称焦性葡萄酸，也称2-氧代丙 酸，是一种最简单的α-酮酸，是参与整个生物体基本代谢的关键中间产物之一，其分子式为C3H4O3，分子量为88.06。丙 酮酸可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸之间的互相转化，因此在三大营养物质的代谢平衡中起着重要的枢纽作用。丙 酮酸作为一种核心代谢分子，可通过多种代谢途径被合成和利用，例如糖酵解和丙氨酸转氨等多种代谢途径。丙 酮酸可以在葡萄糖进行糖酵解的过程中，由磷酸烯醇式丙 酮酸产生。在有氧条件下，丙 酮酸可以进入柠檬酸循环被氧化分解，也可以通过糖异生途径转化回碳水化合物(如葡萄糖)，或通过乙酰辅酶A反应转化为脂肪酸。在无氧呼吸时，丙 酮酸可以转化为乳酸或者乙醇。此外，丙 酮酸可以通过氨基转移反应直接生成丙氨酸。在多数情况下，丙 酮酸浓度的升高不会在组织内积累以致产生有害的作用，但当肝脏发生严重病变或存在遗传性代谢紊乱时血液中丙 酮酸浓度会升高。因此，丙 酮酸的含量检测对疾病的检测和治疗有重要意义[1,2]。

本试剂盒中的Amplex Red是一种对H2O2高度敏感的荧光探针。在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)存在的情况下，Amplex Red能与H2O2 1:1反应，产生强烈的红色荧光物质试卤灵(Resorufin)。试卤灵的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收。因此本试剂盒可以用吸光度和荧光两种方法来进行检测。

本试剂盒的检测原理请参考图1。在黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)、硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate, TPP)和镁离子(Mg2+)的存在下，丙 酮酸(Pyruvic acid)在丙 酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase, PO)的作用下和氧气发生氧化反应生成乙酰磷酸(Acetyl phosphate)、CO2和H2O2，再通过检测H2O2与Amplex Red的反应产物试卤灵(Resorufin)的荧光强度或吸光度来最终计算样品中丙 酮酸的含量。试卤灵的荧光强度或吸光度与样品中丙 酮酸的含量成正比。

图1.碧云天Amplex Red丙 酮酸检测试剂盒(S0299)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为20µl时，采用吸光度检测可以检测浓度低至10μM的丙 酮酸，在10-500μM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测可以检测浓度低至1μM的丙 酮酸，在1-200μM浓度范围内有良好的线性关系。荧光检测的灵敏度比吸光度检测高约10倍，可以使用更少量的样品。本试剂盒提供了丙 酮酸标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，计算出样品中的丙 酮酸含量。

图2.碧云天Amplex Red丙 酮酸检测试剂盒(S0299)检测丙 酮酸标准品的标准曲线。左图为吸光度检测，右图为荧光检测。本试剂盒采用吸光度检测时，在10-500µM浓度范围内有良好的线性关系；采用荧光检测时，在1-200µM浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒检测方法灵活，检测速度快。本试剂盒既可以进行荧光检测，也可进行吸光度检测。整个检测过程约30分钟即可完成。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒应用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0299S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
S0299S-2	Pyruvate Assay Buffer	20ml
S0299S-3	Amplex Red	200μl
S0299S-4	Enzyme Solution A	200μl
S0299S-5	Enzyme Solution B	200μl
S0299S-6	Cofactor	200μl
S0299S-7	Pyruvate Standard (10mM)	200μl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中Amplex Red和Cofactor须避光保存。

注意事项：

Amplex Red在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在使用过程中需注意适当避光。

Amplex Red的反应产物在还原剂的存在下会很不稳定，因此最终反应体系中的二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、或类似还原剂的浓度应低于10µM。

请确保反应体系的pH值在7-8之间，否则会影响Amplex Red的稳定性和荧光值。

Amplex Red和Pyruvate Assay Buffer需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。

为减少稀释液产生的荧光背景带来的误差，样品和标准品的稀释液应该根据样品的种类来定。当样品为BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织的裂解样品时，应使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释，当样品为血液等其它样品时，宜使用Pyruvate Assay Buffer稀释。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。