pET-N-His-TEV-QUEEN NA (ATP荧光探

pET-N-His-TEV-QUEEN NA (ATP荧光探针对照质粒)是碧云天研发的一种用于在细菌中表达ATP荧光探针QUEEN2m或QUEEN7µ时，作为对照的原核工具质粒，可以用于活体实时检测单个细菌内ATP水平时的对照，也可以用于QUEEN NA的原核表达纯化。

通常本产品用作D2906 pET-N-His-TEV-QUEEN2m (细菌ATP荧光探针)或D2907 pET-N-His-TEV-QUEEN7µ (高灵敏度细菌ATP荧光探针)的阴性对照使用。

本质粒N端His标签后含有TEV酶切位点，可通过TEV Protease (P2307/P2308)切除N端的His标签。

QUEEN (Quantitative Evaluator of Cellular Energy)是一个单一的环状排列的荧光蛋白(circularly-permuted fluorescent protein)和细菌ATP结合蛋白融合表达而成。QUEEN对细菌生长速率的改变不敏感(insensitive to bacteria growth changes)。许多细菌细胞内根据QUEEN的荧光所计算的胞内ATP浓度与根据萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)方法检测所计算得出的胞内ATP浓度几乎完全一致，因此QUEEN适合用于定量检测细菌内的绝对ATP浓度。从很多单个细菌收集的QUEEN荧光信号进行分析时发现，即使是遗传背景相同的大肠杆菌细胞，在相同培养条件下，细胞内的绝对ATP浓度也是不同的。

基因编码的ATP荧光探针QUEEN7µ荧光蛋白，由环型排列的增强型绿色荧光蛋白cpEGFP (circularly-permuted enhanced green fluorescent protein)插入到嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基的两个α螺旋之间组成，在接头处分别由两个氨基酸的接头(TR和LG)进行连接。当ATP结合于FoF₁-ATP合成酶的ε亚基的时候，会引起整个蛋白发生构象变化。激发波长400nm/发射波长513nm的荧光强度与激发波长494nm/发射波长513nm的荧光强度的比值对ATP的浓度变化做出响应。QUEEN7µ是一个高亲和力的ATP荧光探针(Kd~7µM at 25℃)，但对ADP没有亲和力。对于正常的活细菌而言，QUEEN7µ对ATP的亲和力可能过高，而较难检测出较高浓度ATP水平的变化。但对于特定条件导致的细菌内低ATP水平时，比较适合使用QUEEN7µ进行ATP的荧光检测。也可以使用表达纯化的QUEEN7µ进行体外体系的ATP实时浓度检测。

基因编码的ATP荧光探针QUEEN2m荧光蛋白，是QUEEN7µ的突变体，通过用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基的1-107aa取代QUEEN7µ中的源自嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF₁-ATP合成酶ε亚基的1-107aa。仍然以激发波长400nm/发射波长513nm的荧光强度与激发波长494nm/发射波长513nm的荧光强度的比值对ATP的浓度变化做出响应。但QUEEN2m是一个低亲和力的ATP荧光探针，更适合检测ATP的生理浓度(Kd~4.5mM at 25℃)。高浓度的ADP会对QUEEN2m信号产生负面影响，但效果相对较小(在生理ADP浓度下约为10%或更少)。此外QUEEN2m信号在pH7.3-8.8和生理Mg²⁺浓度(1-2mM)范围内几乎不受影响。

基因编码的ATP探针QUEEN NA荧光蛋白，是QUEEN2m的突变体，使用源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基的110-132aa取代QUEEN2m中的源自嗜热芽孢杆菌(thermophilic Bacillus) PS3的FoF₁-ATP合成酶ε亚基的110-133aa，并突变了两个位点(R122K/R126K)，使QUEEN-NA失去了对ATP的亲和作用。因此QUEEN NA可用作QUEEN2m或QUEEN 7µ的阴性对照。

图1.QUEEN7µ、QUEEN2m和QUEEN NA的蛋白结构图。

本质粒含有T7启动子/lac操纵子，可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白表达。在多克隆位点的前面，带有一个His标签的编码序列，含有6个组氨酸(6X His)。

本载体在N端His标签与多克隆位点之间含有TEV蛋白酶(TEV Protease)识别的七肽序列ENLYFQG，对应的核酸序列为GAGAACCTGTACTTCCAAGGG，因此可在QUEEN NA蛋白纯化后用TEV蛋白酶切除N端His标签。TEV蛋白酶酶切发生在七肽序列的Q和G之间，因此在酶切去除His标签的时候目的蛋白的N端会留下一个额外的氨基酸残基G。

通常可以采用如BeyoGold™ His-tag Purification Resin (P2210/P2218/P2220)或His标签蛋白纯化试剂盒(P2226)等纯化His标签的QUEEN NA，也可以使用His-tag抗体(AH367)检测和少量地分离纯化QUEEN NA。

本质粒为卡那霉素抗性。

pET-N-His-TEV-QUEEN NA质粒的主要信息如下：

pET-N-His-TEV-QUEEN NA质粒(6420bp)的图谱如下：

pET-N-His-TEV-QUEEN NA中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pET-N-His-TEV-QUEEN NA)包括：

pET-N-His-TEV-QUEEN NA中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pET-N-His-TEV-QUEEN NA)包括：

pET-N-His-TEV-QUEEN NA的全序列信息:D2909 pET-N-His-TEV-QUEEN NA全序列.txt

包装清单：

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。