pCMV-NLS-AT1.03 (细胞核ATP荧光探针)

pCMV-NLS-AT1.03 (细胞核ATP荧光探针)是碧云天自行研发的含有CMV启动子用于在哺乳动物细胞核中表达带有核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)的AT1.03蛋白以作为细胞核ATP荧光探针的工具质粒。本质粒表达的ATP荧光探针被称为ATeam，即基于FoF₁-ATP合成酶ε亚基的ATP指示剂(Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一种低亲和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃)，可以检测毫摩尔级的ATP水平。pCMV-NLS-AT1.03质粒在转染哺乳动物细胞后，AT1.03蛋白由于带有核定位信号主要分布在细胞核中，适合用于实时监控细胞核内的ATP浓度变化。

pCMV-NLS-AT1.03 (细胞核ATP荧光探针)也可以用作细胞核荧光探针，在活细胞中或细胞固定后标记细胞核的位置和形态。

AT1.03蛋白是以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)为基础的实时监测单个活细胞内的ATP水平及其实时变化的ATP荧光探针。该荧光探针由N端的青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激发光波长435nm，发射光波长475nm)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基以及C端的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激发光波长515nm，发射光波长527nm)融合而成。枯草芽孢杆菌的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基是几乎最小的ATP结合蛋白(14kDa)，它由一个N端β桶状结构域和两个C端α螺旋结构域组成。作为基于FRET的ATP荧光探针，FoF₁-ATP合成酶的ε亚基具有几个突出优点：ε亚基与ATP结合，但不水解ATP；结合ATP，但不结合ADP、GTP、CTP以及UTP；当ATP结合时，ε亚基发生很大的构象变化形成一个折叠的构象(folded form)，从而使N端的青色荧光蛋白以及C端的黄色荧光蛋白得以在空间上接近，而发生荧光共振能量转移(激发光波长435nm，发射光波长527nm)。带有核定位信号的AT1.03蛋白和不带有核定位信号的AT1.03蛋白相比，完全保留了AT1.03蛋白的以FRET为基础的ATP荧光探针的功能。

图1.NLS-AT1.03蛋白结构图，N端融合了核定位靶向信号(SV40大T抗原三联体)。SV x3为细胞核定位信号。

pCMV-NLS-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果请参考图2。

图2.pCMV-NLS-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果图。A图为明场照片，B图为荧光照片。

AT1.03的荧光信号在pH7.1-8.5之间非常稳定，这样AT1.03的荧光信号在正常细胞质内(pH7.3左右)几乎不会发生波动。ATP的结合常数_Kon为1.7×10^-2mM^-1s^-1，ATP的解离常数_Koff为9.8×10^-2s^-1，因此AT1.03可用于监控细胞内高达0.1s^-1 ATP的动态变化，特别适合用于实时监测超短时间内的ATP浓度变化。带有核定位信号的AT1.03蛋白和不带有核定位信号的AT1.03蛋白相比，pH稳定性、结合常数、解离常数等性能基本一致。

本质粒为卡那霉素抗性，转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-NLS-AT1.03质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	1–602
T3 promoter and T3 primer binding site	620–639
NLS-AT1.03	699-2597
multiple cloning site	651-692/2598-2621
T7 promoter and T7 primer binding site	2644–2692
SV40 polyA signal	2704–3087
f1 origin of ss-DNA replication	3225–3529
bla promoter	3554–3678
SV40 promoter	3698–4036
neomycin/kanamycin resistance ORF	4071–4862
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal	4863–5321
pUC origin	5450–6117

pCMV-NLS-AT1.03质粒(6169bp)的图谱如下：

 

pCMV-NLS-AT1.03中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-NLS-AT1.03)包括：

AclI	AfeI	AflII	AgeI	AhdI	AscI	AsiSI
BaeI	BbsI	BbvCI	BlpI	BsiWI	BsmBI	BspEI
BspQI	BssHII	BstEII	BstZ17I	EarI	EcoNI	Esp3I
FseI	HindIII	NruI	PflMI	PmeI	PmlI	PpuMI
PshAI	PspXI	SalI	SapI	SbfI	ScaI	SgrAI
SwaI	XcmI	XmnI

pCMV-NLS-AT1.03中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-NLS-AT1.03)包括：

AccI	GT`MK,AC	1495	NarI	GG`CG,CC	4199
ApaLI	G`TGCA,C	5803	NdeI	CA`TA,TG	240
BamHI	G`GATC,C	687	NheI	G`CTAG,C	597
BclI	T`GATC,A	2858	NotI	GC`GGCC,GC	668
BglII	A`GATC,T	2598	PaeR7I	C`TCGA,G	2604
BmgBI	CAC|GTC	1835	PciI	A`CATG,T	6117
BmtI	G,CTAG`C	597	PflFI	GACN`N,NGTC	4317
BsaI	GGTCTCN`NNNN,	5188	PluTI	G,GCGC`C	4198
BsaXI	,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN`	3248	PvuI	CG,AT`CG	2702
BsrDI	GCAATG,NN`	4430	RsrII	CG`GWC,CG	4715
BsrGI	T`GTAC,A	2053	SacI	G,AGCT`C	651
BstBI	TT`CG,AA	4881	SacII	CC,GC`GG	660
BstXI	CCAN,NNNN`NTGG	659	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	3971
CspCI	,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN`	380	SfoI	GGC|GCC	4200
DraIII	CAC,NNN`GTG	3314	SmaI	CCC|GGG	682
Eco53kI	GAG|CTC	653	SnaBI	TAC|GTA	346
EcoRI	G`AATT,C	1854	SpeI	A`CTAG,T	2616
EcoRV	GAT|ATC	1508	SrfI	GCCC|GGGC	682
HincII	GTY|RAC	2964	StuI	AGG|CCT	4020
HpaI	GTT|AAC	2964	TspMI	C`CCGG,G	680
KasI	G`GCGC,C	4198	Tth111I	GACN`N,NGTC	4317
MfeI	C`AATT,G	2951	XbaI	T`CTAG,A	2610
MluI	A`CGCG,T	3087	XhoI	C`TCGA,G	2604
MscI	TGG|CCA	4218	XmaI	C`CCGG,G	680

如需对pCMV-NLS-AT1.03质粒中插入片段NLS-AT1.03进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

T7 primer (2644–2692): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

pCMV-NLS-AT1.03的全序列信息:D2605 pCMV-NLS-AT1.03全序列.txt

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D2605-1μg	pCMV-NLS-AT1.03 (细胞核ATP荧光探针)	1μg
D2605-100μg	pCMV-NLS-AT1.03 (细胞核ATP荧光探针)	100μg
－	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。