人脐带血单个核（PBMC）细胞分离液KIT

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【实验前准备】
1. 适用仪器
最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。
（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟左右。）
2. 实验最佳分离时间
为获得最佳的实验结果，最好在取样 2h 内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
3. 分离液的使用环境
a. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；
b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。
4. 无菌离心管
本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于 80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞，请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃，冬季 25℃。）的条件下进行。
【组织样本单细胞悬液的制备】
1. 取组织块称重后，用眼科剪刀无菌操作，将组织剪成小块。
2. 将组织块放在 70µm 细胞筛网(产品编号：TBDTM-SC，需要另购)上，用研磨器反复揉搓，边揉搓边加入匀浆冲洗液 (以 0.1g 组织为例，约加 5-8ml)，使细胞全部通过筛网冲到离心管中。
注：需要让细胞形成单细胞悬液冲到离心管中，而不是被研磨挤压到离心管中。
目的：使组织形成单个的细胞，而不是成团或碎片组织。单个的细胞更易分离。
3. 弃去筛网，组织研磨液经 450g，离心 10min，弃上清。
4. 用组织样本稀释液重悬组织细胞，将细胞悬液细胞浓度调整为 2×108--1×109/ml (以0.1g 组织为例，约使用 1ml 组织样本稀释液重悬细胞)，备用。

单核细胞层和单个核细胞层混在一起不能分开
1. 吸取全部白色环状细胞层，清洗后用组织样本稀释液 1-2ml 重悬细胞。
2. 使用分离液 2 重新提取淋巴细胞。
3. 取 15ml 离心管，加入 4ml 分离液 2，将用组织样本稀释液重悬的 1-2ml 细胞缓慢加于
分离液之液面上，400g，离心 20min。
4. 离心后，离心管可分为 4 层，第一层稀释液层，第二层单核细胞层，第三层分离液层，
第四层淋巴细胞层。
5. 可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得淋巴细胞

可能存在的问题及解决方法】
1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：
出现情况 出现原因 建议解决方案
离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层 转速过小或离心时间过短
适当增减转速
离心后目的细胞存在于分离液中 转速过大或离心时间过长
离心后白环层弥散 细胞密度过大
调整细胞密度
离心后白环层太浅或看不见 细胞密度过