转基因水稻LLRICE62核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）

【产品名称】 
通用名称：转基因水稻LLRICE62核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
Name ：Diagnostic Kit for Rice62 Gene DNA （Real-Time PCR Method）
【包装规格】50T/盒
【预期用途】 本试剂盒适用于检测转基因植物的Rice62 基因，用于筛查待检测植物中是否含有 Rice62 成分。其检测结果仅供参考。
【检验原理】 本试剂盒用国家标准的 Rice62 特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术进行转基因成分的检测。

【试剂组成】

包装规格	50T/盒
LLRICE62 反应液	500μL×2 管
酶液	50μL×1 管
LLRICE62 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】 -20℃避光保存、运输、避免反复冻融，有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】 称取 200g 样品。
【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 0℃冰壶。

【使用方法】
1.    样品处理（样本处理区）
1.1    样本前处理 固体样本：用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。
1.2    DNA 提取 对于固体标本，DNA 的提取可以采用 SN/T 2584-2010 中推荐的方法：
1)    每个样品取 2 个平行管。称取 200mg 粉碎的样品，加入 1mL 预冷至 4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静止 5min，4℃条件下10000g 离心 15min，弃上清液； 2)    加入 600uL 预热至 65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在 65℃恒温保持 40min，期间颠倒混匀 5 次；
3)    室温条件下 10000g 离心 10min，取上清液转移至新离心管中，加入 5uLRNAseA，37℃恒温 30min，分别用等体积苯酚：异戊-醇溶液和三氯jia烷：异戊-醇溶液各抽提一次；
4)    室温条件下，10000g 离心10min，取上清液至新离心管，加入三分之二体积的异丙醇，十分之一体积的3mol/L 的乙酸钠溶液（pH=6.5）， -20℃放置 2-3h；
5)    在 4℃条件下，10000g 离心 15min，弃上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；
6)    加入 50uL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即为样品 DNA 溶液。也可使用等效的 DNA 提取试剂盒。 油脂样本请直接选用市售油脂 DNA 提取试剂盒，按说明操作。 2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)， 每测试反应体系配制如下表：

试剂	LLRICE62 反应液	酶液
用量（样本数为 N）	20μL	1μL

3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的
4.    反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye） 选择 NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。
4.3    推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	95℃	10min	否
2	40 cycle	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

5.    结果分析判定
5.1    结果分析条件设定 设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线； 可疑：检测通道 3538 或无 Ct 值。
6.    检测方法的局限性
    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
7.    质控标准 阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
【注意事项】
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器； 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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