流行性造血器官坏死病毒（EHNV）核酸检测试剂盒（探针法荧光

产品名称：流行性造血器官坏死病毒（EHNV）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
英文名称：Epizootic Hematopoietic Necrosis Virus Probe qPCR Kit
产品介绍：流行性造血器官坏死病毒(Epizootic Hematopoietic Necrosis Virus，EHNV)是一种双链 DNA 病毒，属于虹彩病毒科、蛙病毒属(Ranavirus)。流行性造血器官坏死病毒会引起有鳍鱼类的系统性临床或亚临床感染，主要感染河鲈、虹鳟、欧鲇和鮰，能够引起这些鱼类出现内脏坏死乃至死亡。我国是鲈鱼和虹鳟养殖大国，如果发生流行性造血器官坏死病毒感染会给我国水产养殖业造成巨大经济损失，因此快速检测流行性造血器官坏死病毒具有重要的意义。为此，本公司以探针法 qPCR 技术为基础开发了流行性造血器官坏死病毒的检测试剂盒。
产品特点：
1.    即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2.    引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。
3.    提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.    特异性高，引物是根据流行性造血器官坏死病毒 DNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 DNA 发生交叉反应。
5.    既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。
6.    本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法 qPCR 反应。
7.    本产品只能用于科研。

 【试剂组成】

包装规格	50T/盒
EHNV 反应液	500μL×2 管
酶液	50μL×1 管
EHNV 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】 对虾受精卵、幼体、仔虾取完整个体；幼虾至成虾阶段取去除眼柄的头胸部(肝胰腺、鳃丝、心脏等)、肠组   织或粪便。受精卵、幼体、仔虾或达到 0.5 g 样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检验。所取样品分别置于 1.5 mL 离心管中，立即进行 DNA 提取操作或于-20℃暂时保存。
【保存和运输】 采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】
1.    样品处理（样本处理区）
1.1    样本前处理 取 0.5g 样品于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2    核酸提取 推荐采用上海烜雅生物科技有限公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进    行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 

试剂	EHNV 反应液	酶液
用量（样本数为 N）	19μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；  
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3    推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	95℃	2min	否
2	45 cycle	95℃	15sec	否
		60℃	30sec	是

5.    结果分析判定
5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3    质控标准 阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6.    检测方法的局限性
1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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