猪传染性胸膜肺炎核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）

【产品名称】  
商品名称：猪传染性胸膜肺炎核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
Name    ：porcine contagious pleuropneumonia Detection Kit（Real-Time PCR Method）
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种以急性胸膜肺炎为特征的猪的呼吸道传染病。病理特征是纤维性胸膜肺炎和出血坏死性肺炎。该病多以最急性型发生，并很快    引起猪的死亡，慢性型的导致生长缓慢，成为僵猪，降低饲料报酬，造成很大经济损失。荧光 PCR 技术法因其简便、快捷、灵敏度高、特异性强成为 APP 检测的主要手段之一。 本试剂盒适用于检测鼻腔分泌物、具有典型病变的肺气管、肺门淋巴结、扁桃体等样本中的传染性胸膜肺炎   放线杆菌，用于传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的辅助诊断。
【检验原理】 本试剂盒采对传染性胸膜肺炎放线杆菌基因保守区设计特异性引物探针，用荧光 PCR 技术对传染性胸膜肺炎放线杆菌的 DNA 进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染病料的病原学检测。

 【试剂组成】

包装规格	50T/盒
PCP 反应液	500μL×2 管
酶液	50μL×1 管
PCP 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】 病死或扑杀猪，无菌采集具有典型病变的肺气管、肺门淋巴结、扁桃体；待检活猪，用棉拭子采鼻腔分泌物，   放入无菌试管中。
【保存和运输】 采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】
1.    样品处理（样本处理区）
1.1    样本前处理 组织样品：取组织 0.5g~1g 剪碎，加入 1mL PBS 缓冲液，研磨成匀浆。将组织匀浆液 100g 离心 5min，弃沉淀，取上清用于后续的核酸提取，如果上清液不足 200μL，补充生理盐水至 200μL。 拭子样本：鼻拭子在 1 mL PBS 缓冲液中反复挤压，将挤下的液体 100g 离心 5 min，弃沉淀，取上清用于后续的核酸提取，如果上清液不足 200μL，补充生理盐水至 200μL。
1.2    核酸提取 推荐采用上海烜雅生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请   按照试剂说明书进行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 

试剂	PCP 反应液	酶液
用量（样本数为 N）	19μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。  
3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3    推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	95℃	2min	否
2	45 cycle	95℃	15sec	否
		60℃	30sec	是

5.    结果分析判定
5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3    质控标准 阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6.    检测方法的局限性
1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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