鼠源性成分（Mouse）核酸检测试剂盒(探针法荧光PCR)

鼠源性成分（Mouse）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）  
通用名称：鼠源性成分（Mouse）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）
Name：Diagnostic Kit for Mouse derived ingredients DNA(Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】 食品的质量与安全问题日益成为社会关注的焦点。近年来，市面上不断出现用鼠肉冒充牛、羊肉事件，引起社会广泛关注。老鼠多生活于潮湿脏乱的环境中，携带多种细菌病毒，易造成严重的食品安全隐患。荧光 PCR 技术以其高灵敏度和特异性，可检测熟肉和混合样本的特点，以逐步成为肉类成分鉴别的主流技术[1]。 本试剂盒适用于食品、饲料等样本中鼠源性成分的检测。
【检验原理】 本试剂盒采用TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对鼠类基因高度保守区特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对鼠类基因高度保守区的 DNA 进行体外扩增检测，从而达到快速检测之目的。
【试剂组成】 包装规格    50T/盒 Mouse 反应液    500μL×2 管 酶液    50μL×1 管 Mouse 阳性质控品    50μL ×1 管 阴性质控品    250μL ×1 管 说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】 取动物组织及其制品、食品或饲料约 1g。
【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】
1.    样品处理（样本处理区） 1.1    样本前处理 取动物组织及其制品、食品或饲料约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。 1.2    核酸提取 推荐采用本公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表： 试剂    Mouse 反应液    酶液 用量（样本数为 N）    20μL    1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。
3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3    推荐循环参数设置： 步骤    循环数    温度    时间    收集荧光信号 1    1 cycle    95℃    10min    否 2    40 cycles    94℃    15sec    否         55℃    30sec    是
5.    结果分析判定
5.1    结果分析条件设定 设置Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线； 可疑：检测通道 3538 或无 Ct 值。
6.    质控标准 阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.    检测方法的局限性
1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1]    Kesmen Z, Gulluce A, Sahin F, et al. Identification of meat species by Taqman-based real-time PCR assay [J]. Meat Sci, 2009, 82(4): 444-449.
[2]    周如华, 张玉红, 黄洪武, 等. 实时荧光定量 PCR 检测羊肉制品中鼠源性成分. 中国法医学杂志, 2014, 29(6): 534-537.