鼠呼肠孤病毒3型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

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产品名称：鼠呼肠孤病毒3型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
保存条件：-20℃
保质期：12个月
包装规格及成分（具体信息详见说明书）：

通用原则
1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针；
2. 扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100－150bp内，扩增片断越短，有效的扩增反应就越容易获得，较短的扩增片断也容易保证分析的一致性；
3. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号；
4. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）；
5. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
 探针设计指导
1. 在设计引物之前设计探针；
2. 探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区；
3. 探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在；
4. 选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
5. 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。
6. 检测探针的DNA折叠和二级结构。
 引物设计指导
1. 引物的Tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。
2. 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
3. 将引物尽量接近于探针

设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做（可以选4号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。

鼠呼肠孤病毒3型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒数据处理
1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的 log 值，再推算出其浓度。
2. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 39。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于40 则为阴性，如果小于或等于 39 则为阳性。如果在 39-40 之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

下面介绍我公司部分一两种产品，更多产品请联系我们
本公司一管式植物DNAOUT产品及特点：
本产品是一管式超快植物种子和叶片基因组DNA 提取试剂，得到的产物可以直接用于PCR。整个过程简单快速，尤其适合于大规模的转基因植物筛选时样品的制备。
1. 快速，整个过程只需要15分钟左右，不需要液氮对植物组织进行冰冻、机械处理、纯化或者DNA的沉淀。运输及保存2. 一管式，在一个试管内完成所有操作，不容易交叉污染。常温运输及保存，有效期一年。
3. 裂解液可以直接用于PCR，剩余样品可以在4℃保存一月以上。
4. 便于高通量和自动化，适合于海关和企业进行大规模的GMO PCR 筛选。
5. 适用于大多数植物叶片和种子。
使用及效果：将压碎的一小片重量约在100 mg 左右的植物种子（约1/4 黄豆大小）或直径约为0.5-0.7 cm（或面积相当的其他形状）的植物叶片直接加到新鲜配制的0.1 mL溶液A 中，95℃保温10-15 分钟，加入0.1 mL 溶液B，混匀，直接取上清液（相当于PCR 体积的1/10）作为模板进行PCR。剩余样品可以放4℃保存。
我公司即用型PCR试剂盒：
运输及保存：低温运输、-20℃保存，有效期一年。
二，即用型PCR试剂盒的改良产品， 含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等所有PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR 反应，具有广泛的用途。
1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR 实验。
2. 快捷，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。
4. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能扩增各种常见的DNA 样品。
5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。
 使用及效果：将本产品15 μL 与用户自备的模板，引物和水共15 μL 混合后，直接进行PCR反应（PCR 参数由用户自己确定），反应结束后直接取10 μL 电泳检查扩增结果。

鼠呼肠孤病毒3型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒检测方法的局限性
A.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
B.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
C.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
D.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
E.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
F.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

鼠呼肠孤病毒3型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒注意事项
1操作严格按照说明书进行；
2试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3反应液应避光保存；
4反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；