FLUC-人恶性黑色素瘤细胞(A375)

►细胞接收
1.冻存细胞：如果是干冰运输的冻存细胞，收到后请立即转入液氮储存保存，或直接进行细胞复苏。
2. 活细胞：收到后用75%的酒精对T25瓶外表面进行消毒，之后放在5% CO2、37℃的细胞培养箱静置2 h，静置后取出细胞瓶在显微镜下观察细胞贴壁情况和细胞汇合度，分别在100X和40X下各拍2个不同视野的细胞拍照记录。如果汇合度达到80%以上的传代密度，可以进行传代操作，如果细胞汇合度没有达80%以上，弃掉瓶内培养基，更换新鲜完全培养基。（培养瓶中灌满的细胞培养基不能继续用来培养细胞。）
    注意：收到细胞后，活细胞首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否漏液、浑浊等现象。冻存细胞若发现干冰已挥发完、冻存管瓶盖脱落、破损等异常情况，请务必拍照保留，并于收货24 h内与我们联系。

►细胞复苏
1. 准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置数分钟让残余液氮挥发；
2. 在超净台内用吸管吸取6-7 mL完全培养液至15 mL离心管中；
3. 将细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化；
4. 在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干。用单道移液器将所有融化的细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，500 xg室温离心4分钟收集细胞；
5. 超净台内小心吸弃上清，用单道移液器吸取1 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有4 mL完全培养液的T25 cm2培养瓶 (或者6 cm2的皿)中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

►细胞传代
贴壁细胞：
1. 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃；
2. 从培养容器中吸弃上清；
3. 从容器一侧轻轻加入PBS（T25培养瓶加入约2 mL）洗涤细胞1次。注意动作轻柔，清洗全面，避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次吸去PBS（注：冲洗步骤可去除可能抑制解离剂作用的少量血清、钙和镁）；
4. 加入胰酶（T25培养瓶加入约1 mL），摇晃均匀，保证充分接触细胞表面。放入培养箱消化；
5. 显微镜下观察消化情况，约70％～80％细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面；
6. 立即加入2-3倍胰酶体积的完全培养基（T25培养瓶加入约3 mL），随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化；
7. 使用移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来；注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，损伤和损失细胞。
8. 收集的所有细胞悬液以500 g离心5 min；
9. 离心后去除上清。加入1 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀；
10. 将细胞按一定的比例传代接种，建议首次按照1:2进行传代，若细胞在两天内长满可增加传代比例，若细胞生长三四天还未长满，可适当缩小传代比例；
     注意：请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
11. 摇匀细胞，放入37℃、5％CO2的培养箱中（如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通气式培养瓶和透气性瓶盖）；
12. 传代次日，观察细胞状态。若发现较多死细胞，进行换液操作。之后，每天根据细胞的生长情况更换完全培养基，观察细胞，生长至80％以上的汇合度，即需传代或冻存。
    注意：为了维持Fluc基因表达量的稳定，建议传代时半药维持。

悬浮细胞：
1. 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃；
2. 使用移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来；
    注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，损伤和损失细胞。
3. 收集的所有细胞悬液以500 g离心4 min；
4. 离心后去除上清。加入1 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀；
5. 将细胞按一定的比例传代接种，建议首次按照1:2进行传代，若细胞在两天内长满可增加传代比例，若细胞生长三四天还未长满，可适当缩小传代比例；
    注意：请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
6. 摇匀细胞，放入37℃、5％CO2的培养箱中（如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通气式培养瓶和透气性瓶盖）；
7. 传代次日，观察细胞状态。若发现较多死细胞，进行换液操作。之后，每天根据细胞的生长情况更换完全培养基，观察细胞，生长至80％以上的汇合度，即需传代或冻存。
     注意：为了维持Fluc基因表达量的稳定，建议传代时半药维持。

半贴壁半悬浮细胞：
1. 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃；
2. 使用移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来；
     注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，损伤和损失细胞。
3. 从容器一侧轻轻加入PBS（T25培养瓶加入约2 mL）洗涤细胞1次。注意动作轻柔，清洗全面，避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次吸去PBS（注：冲洗步骤可去除可能抑制解离剂作用的少量血清、钙和镁）；
4. 加入胰酶（T25培养瓶加入约1 mL），摇晃均匀，保证充分接触细胞表面。放入培养箱消化；
5. 显微镜下观察消化情况，约70％～80％细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面；
6. 立即加入2-3倍胰酶体积的完全培养基（T25培养瓶加入约3 mL），随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化；
7. 使用移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来；注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，损伤和损失细胞。
8. 收集的所有细胞悬液以500 g离心5 min；
9. 离心后去除上清。加入1 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀；
10. 将细胞按一定的比例传代接种，建议首次按照1:2进行传代，若细胞在两天内长满可增加传代比例，若细胞生长三四天还未长满，可适当缩小传代比例；
      注意：请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
11. 摇匀细胞，放入37℃、5％CO2的培养箱中（如果使用培养瓶，将其放入培养箱前应将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换，除非您使用的是通气式培养瓶和透气性瓶盖）；
12. 传代次日，观察细胞状态。若发现较多死细胞，进行换液操作。之后，每天根据细胞的生长情况更换完全培养基，观察细胞，生长至80％以上的汇合度，即需传代或冻存。
     注意：为了维持 Fluc基因表达量的稳定，建议传代时半药培养。

►细胞冻存
1. 按细胞传代的方法，收集细胞沉淀，根据沉淀大小加入适量培养基重悬细胞。
2. 用移液管吹打混合均匀，取20 μL进行细胞计数；
3. 500 g室温离心5 min，离心后，打开盖子吸去上清，用1~2 mL 4℃预冷的冻存液重悬细胞，随后加入冻存液调整至密度为1x106-1x107个细胞/mL；
4. 将细胞悬液按1 mL每管平均分装至冻存管中，旋紧盖子，冻存管应提前贴好细胞名称、细胞代次、数量、冻存日期；
5. 将冻存管放置于4℃预冷的程序降温盒中，并在冻存结束的15分钟之内将程序降温盒放置超低温冰箱内；
6. 过夜后，将冻存细胞转移至液氮罐内保存。