MaxEndoFree无内毒素质粒小提中量试剂盒

MaxEndoFree无内毒素质粒小提中量试剂盒
产品及特点
本试剂盒适用于无内毒素质粒 DNA 的小提中量制备。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。再经内毒素清除液清洗，可将绝大多数菌体内毒素清除干净，然后通过清洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质，最后在低盐、高 pH 条件下洗脱得到高纯度无内毒素的质粒DNA。使用本试剂盒可从5 - 15 ml 过夜培养的菌液中纯化得到高达70μg 的无内毒素质粒DNA，所得质粒除可用于常规分子生物学实验外，还适合细胞株的转染实验。
它具有下列特点：
1. 快捷、高效：操作简便，得率高，节约时间；
2. 纯度高：沉淀致密，去杂干净；
3. 内毒素去除简单：柱上去除内毒素，方便快速，清除干净。
保存条件
在室温(15-25℃)干燥条件下，可保存 12 个月；更长时间的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1 应置于 2-8℃ 保存，可稳定保存 6 个月。
使用方法
柱平衡：
向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 400 μl 的平衡液 BL，12,000 rpm(-13,400×g) 离心 1 min，弃收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
1. 取 5 - 15 ml 过夜培养的菌液，室温 12,000 rpm 离心 1 min，尽量将上清去除干净。
（注 意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取 5 ml 菌液离心即可）
2. 加入 500 μl Buffer S1，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
（注 意：菌体沉淀一定要悬浮均匀，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）
3. 加入 500 μl Buffer S2，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变成清亮、粘稠。
（注 意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏）
4. 加入 500 μl Buffer S4，立即颠倒混匀 6-10 次，此时会出现大量漂浮物，12,000rpm离心 10-20 min。
（注 意：Buffer S4 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果离心后上清液中仍有漂浮物，可增加离心时间，转移液体时可轻轻倒入，如果有少量漂浮物倒出，不影响后续实验）5. 小心将上清液转移到一新的离心管中，加入 0.3 倍异丙醇，混匀，将混合液加入离心吸附柱中，12,000 rpm 离心 30 sec，弃收集管中滤液。
（注 意：吸附柱一次只能转移 750 μl 液体，剩余液体分次转入）
6. 向吸附柱中加入 500 μl ToxinOut Buffer，室温静置 5 min，12,000 rpm离心1 min，弃收集管中滤液。
7. 加入 600 μl Buffer W2，室温 12,000 rpm 离心 30 sec，弃收集管中滤液。
（注 意：Buffer W2为浓缩液，要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）
8. 加入 500 μl Buffer W2，室温 12,000 rpm 离心 30 sec，弃收集管中滤液。
9. 干燥。将离心吸附柱于 12,000 rpm 离心 2 min，甩干残留漂洗液。
（注 意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）
10. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 ml 塑料离心管（自备）中，加入100 - 300 μl 的洗脱液 Buffer EB，室温放置 2 min。12,000 rpm 离心 1 min，离心管底溶液即质粒DNA。
（注 意：为增加洗脱效率，可将洗脱液在 60℃预热。如需使用去离子水洗脱，可用NaOH调整其pH值在 7.0 - 8.5 之间，为了增加质粒回收率，可将得到的溶液重新加入到离心管中，室温放置2 min，再次离心收集）
注意事项
1. 细菌培养时间一般为 12 - 16 小时，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质 粒质量甚至导致质粒 DNA 突变。
2. 每次使用时都要注意 Buffer S2 和 S4 是否形成沉淀，如有沉淀37℃溶解后再用。
3. 注意溶液 S1，S2 和 S4 的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量。
4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。