HiPURE高纯度质粒小提试剂盒

HiPURE高纯度质粒小提试剂盒
产品及特点
本试剂盒用于高纯度质粒DNA的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理，质 粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除 杂质，在低盐、高pH条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA 。使用本试剂盒每次 可处理 1-5 ml 过夜培养的菌液，所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR 、测序及转染等 各种分子生物学实验。
它具有下列特点：
1. 快捷、高效：操作简便，得率高，节约时间。
2. 纯度高：沉淀致密，去杂干净。
注意：使用前将全部 RNase A 溶液加到 Buffer S1 中混合均匀，2 - 8℃保存;按要求在 Buffer W1  和 W2 中加入无水乙醇
本产品仅供科研使用，不得用于其它用途
保存条件
在室温(15-25℃)干燥条件下，可保存 12 个月；更长时间的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液产生沉淀，应在使用前置于 37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1  应置于 2-8℃ 保存，可稳定保存 6 个月。
使用方法
柱平衡：
向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入400μl 的平衡液BL ，12,000 rpm (-13,400×g ) 离 心 1 min ，弃收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
1. 取 1-5 ml 过夜培养的菌液，室温 12,000 rpm 离心 1 min ，尽量将上清去除干净。
（注 意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取 1.5 ml 菌液离心即可，浓度低时可多收集一次）
2. 加入 250 μl Buffer S1 ，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。
（注 意：菌体沉淀一定要悬浮均匀，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）
3. 加入 250 μl Buffer S2 ，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变成清亮、粘稠。
（注 意：不可剧烈震荡， 以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min ， 以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Buffer S2的用量，在后续的操作中 Buffer S3 的用量也要相应增加）
4. 加入350μl Buffer S3 ，立即颠倒混匀6-8次，可见白色沉淀物产生，室温静置 2 min， 然后12,000 rpm 离心 5 min。
（注 意：Buffer S3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀）
5. 小心将上清液转移到离心吸附柱中，12,000 rpm 离心 0.5 min ，弃收集管中滤液。
6. 可选步骤：向吸附柱中加入 500 μl Buffer W1 ，12,000 rpm离心0.5 min ，弃收集管中滤液。
（注 意：Buffer W1 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖， 以防酒精挥发。如果宿主菌是endA- ，如DH5α或TOP10 ，此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+ ，如 TG1 、BL21 、HB101、 JM101等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也  推荐采用此步骤）
7. 加入 600 μl Buffer W2 ，室温 12,000 rpm 离心 0.5 min ，弃收集管中滤液。
（注 意：Buffer W2为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖， 以防酒精挥发）
8. 加入 500 μl Buffer W2 ，室温12,000 rpm 离心0.5 min ，弃收集管中滤液。
9. 干燥。将离心吸附柱于12,000 rpm 离心 2 min ，甩干残留漂洗液。
（注 意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）
10. 将吸附柱置于一新的无菌 1.5 ml 离心管（自备）中，加入 50-100 μl 的洗脱液 Buffer EB， 室温放置 2 min ，12,000 rpm 离心 1 min ，离心管底溶液即质粒 DNA。
（注 意：为增加洗脱效率，可将洗脱液在60℃预热。如需使用去离子水洗脱，可用NaOH 调整其pH值在 7.0 - 8.5之间，为了增加质粒回收率，可将得到的溶液重新加入到离心管中，室温放置 2 min， 再次离心收集）
低拷贝或大质粒（>10 kb）提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量，使用 5-10 ml 过夜培养物，同时按照比例增加 Buffer S1 、S2 、S3 的用量，洗脱液 Buffer EB 应在 60℃ 水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。
注意事项
1. 细菌培养时间一般为12-16小时，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒DNA突变。
2. 每次使用时都要注意 Buffer S2 和 S3 是否形成沉淀，如有沉淀 37℃溶解后再用。
3. 注意Buffer S1，S2 和 S3的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液使用量。
4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关，一般 1.5 ml  过 夜培养菌体可收获约10 μg 高拷贝质粒。