miRNA Mimics NC

【产品简介】
生物提供的siRNA为化学合成双链小分子RNA，即用型。

【运输保存】
产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。使用前请瞬时离心，用RNase-free Water配制成20μM储存液，分装保存于-20℃~-80℃，避免反复冻融（不超过5次）。

表1 20μM储存液的配置参考?

siRNA	5 nmol	20 nmol
RNase-free Water	250 μl	1000 μl

使用前须知

产品以冻干粉的形式提供，由于影响结晶形态的因素很多，产品外观有些差异，甚至形态无法用肉眼可见，此为正常现象。
为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

 

【实验指南】
1.实验对照该如何设置？
正式实验为实验组和阴性对照组（a b ），实验组的抑制效果均需与 NC 组比较。
在预实验中设置对照组（c d ），以确认转染试剂及阴性对照无毒副作用，且对基因沉默检测指标无显著干扰影响。
如果对实验细胞转染效率不甚了解，则需要在预实验中设置对照组（d ）进行转染效率检测，以确定适合的转染试剂及转染条件。

常用对照组列表：

a) 实验组：使用目的基因 siRNA 进行转染。

b) 阴性对照组（ NC 组）：使用阴性对照 siRNA 进行转染，用于说明 siRNA 作用的特异性，作为分析目的基因 siRNA作用的参照。

c) 正常细胞对照组（ Blank 组）：未经任何转染处理的细胞，用于观测整个实验过程细胞的生长状态及分析的参考。

d) 转染试剂对照组（ Mock 组）：使用转染试剂进行转染，但不加入 siRNA ，用于排除转染试剂对细胞可能的影响及分析参考。

e) 荧光标记转染对照组：使用荧光对照 siRNA 或转染指示剂 进行转染，用于检测当前转染条件下细胞的转染效率。

f) 阳性对照组：使用已明确有效的 siRNA 进行转染并检测沉默效率，若抑制率高则可说明转染率高且检测方法正常。

2.基因沉默效果不好，该如何改善？
1）提高转染效率
成功的转染是RNAi 实验的前提。若基因沉默效果不佳，则需先排查转染效率方面的问题，可通过检测转染效率或者采用阳性对照 siRNA 验证 RNAi 实验体系。首先 可依据转染试剂说明书进行转染条件（细胞密度，转染试剂用量，转染时间等）优化尝试，其次可尝试在其他细胞类型上进行转染。若由于实验模型限制无法使用其他细胞，可考虑更换转染试剂或转染方法（如电转）。

2）检测目的基因表达水平
若目的基因在实验细胞中的表达丰度很低，是难以得到有效的沉默的。一般目的基因与GAPDH 或 ACTB 的 ΔCt 值为10 以内，比较适合做 RNAi ，若 ΔCt 值达到 15 以上则无法得到有效的沉默效果。对于目的基因表达丰度低的情况，建议更换实验细胞。

3）优化 siRNA 浓度
siRNA在一定的丰度下才能达到 理想的作用效果，故可根据锐博生物的推荐浓度（ 50nmol ）进行预实验测试，再结合实验细胞系类型及目的基因的表达水平设置 siRNA 浓度梯度来优化 siRNA 最适浓度。

4）更换其他 siRNA
若确定转染效果尚佳，其他因素也分析没有问题的情况下，却没有达到理想的基因沉默效果，则可以尝试更换其他siRNA来测试。由于 RNA 本身序列特性，或者靶位点的二级结构复杂等因素，有些 siRNA 的基因沉默效果可能没有那么显著，这种情况下可以尝试更换 siRNA 。

5）检测分析方法有误
引物使用有误，检测时间点设置不合理，对照样本异常，实验样本检测数据不稳定等因素都会对后期实验数据分析造成影响，此类问题需根据具体的问题有针对性地进行分析调整。

6）其它原因
如目的基因的表达调控特性导致其难以沉默，并已排除转染方法，转染效率，基因表达水平及siRNA 浓度等方面的问题，并尝试过 5 对以上 siRNA ，则应考虑更换细胞进行尝试。