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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 灵敏度:
8.33pg/mL
- 库存:
99
- 供应商:
上海普时如生物科技有限公司
- 检测范围:
8.33-25pg/ml
- 检测方法:
酶联免疫吸附测定
- 应用:
仅供科研实验使用,严禁用于临床或其他非科研用途。
- 适应物种:
human(人)
- 标记物:
辣根过氧化物酶(HRP)
- 样本:
血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清
- 规格:
96wells
Human MCP-3(CCL7) ELISA(酶联免疫吸附测定)试剂盒是用于检测人单核细胞趋化蛋白3(MCP-3,也称为CCL7)的一种科研工具。以下是关于Human MCP-3(CCL7) ELISA试剂盒的详细介绍:
一、产品特点与用途
- 特点:重复性好、灵敏性高、特异性强,适用于科学研究。
- 用途:仅供科研使用,不得用于临床诊断。可用于检测人血清、血浆、组织匀浆等样本中的MCP-3含量。
二、检测原理
Human MCP-3(CCL7) ELISA试剂盒的检测原理基于酶联免疫吸附技术。其基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,滴加底物溶液后,底物在酶的作用下发生颜色反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比,从而可以判定样本中MCP-3的含量。
三、实验流程
- 实验前准备:将所有试剂和样本置于室温平衡,按照说明书要求准备标准品、试剂及样本。
- 加样:向酶标板各孔中加入标准品或待测样本,孵育一定时间。
- 加检测溶液:加入检测溶液A,再次孵育。
- 洗板:洗涤去除未结合的成分。
- 加检测溶液B:加入检测溶液B,继续孵育。
- 显色:加入TMB底物溶液,在酶的催化下发生显色反应。
- 终止反应:加入终止液终止显色反应。
- 读数:在特定波长(如450nm)下测定各孔的吸光度值(OD值),根据标准曲线计算样本中MCP-3的含量。
四、保存与运输
- 保存条件:试剂盒应置于2-8℃条件下避光保存,避免反复冻融。开封后的试剂和酶标包被板应密封并置于2-8℃保存。
- 运输方式:一般采用快递运输,使用生物干冰或冰袋保持低温环境。
Human MCP-3 ELISA Kit
用于血清,血浆,细胞上清及其他生物体液中
人单核细胞趋化蛋白3的检测
货号:A1010A0143
96 tests
仅供科研使用,勿用于药物、临床检测
检测原理:
本试剂盒采用双抗夹心法。用抗Human MCP-3抗体包被于酶标板上,标准品和样本中的Human MCP-3与单抗结合,加入生物素化的抗Human MCP-3,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液,在450nm处测OD值,Human MCP-3浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中Human MCP-3的浓度。
试剂盒组份(2-8℃保存)
1. Human MCP-3 酶标板(coated wells),12*8wells(单孔可折),1 plate;
2. Human MCP-3 标准品3.2 ng(standards),1vial;
3. Human MCP-3 200×检测抗体 –HRP 结合物 60μL,1 vial;
4. 稀释液I(Assay Diluent I),30 mL,1 vial;
5. 稀释液 II(Assay Diluent II),12 mL,1 vial;
6. 20×浓缩洗涤液(Wash Buffer),30 mL,1 vial;
7. 显色液A(Color Reagent A),6 mL,1 vial;
8. 显色液B(Color Reagent B),6 mL,1 vial;
9. 终止液(Stop Solution),12 mL,1 vial;
10. 封板膜,3张;
未提供的试剂、仪器和耗材:
1. 单道或多道(8道或12道)移液器及移液器枪头:10-200μL和50-1000μL;
2. 多道(8道或12道)移液器试剂存放槽;
3. EP管及试剂配置容器;
4. 圆柱形量筒:100mL,200mL,500mL和1L;
5. 可在450nm处进行读数的酶标仪; 洗瓶或自动洗板机;
6. 蒸馏水或去离子水;封板膜或板盖;乳胶手套;吸水纸;
注意事项:
1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。
8. 标准孔及待测样本均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线,请合理安排预实验。
9. 不能使用过期产品。
样本与试剂准备:
1. 样本:本试剂盒可检测血清,血浆(EDTA,肝素抗凝),细胞培养上清液,组织匀浆等生物学样本。样本储存要求2-8℃保存48小时以内,更长时间需冷冻(-20℃或-80℃)保存,避免反复冻融。如样本Human MCP-3 含量过高,可用稀释液 I进行稀释。
2. 标准品配制:将3.2ng标准品离心后,加入2000μL的稀释液 I配制成浓度为1600pg/mL的标准品溶液(标准曲线最高点),轻轻振荡混匀。;再准备六支EP管,分别加入500μL稀释液I,吸取1600pg/mL的标准品溶液500μL加入第一管中,充分混匀,从第一管中取500μL加到第二管中,充分混匀,如此反复对半稀释至浓度25pg/mL的标准品溶液;另取一空白EP管加入足量的稀释液I,设为空白对照。

3. 1×检测抗体 –HRP 结合物:用稀释液 II按1:200倍稀释200×检测抗体 –HRP 结合物。
4. 显色液配制:A液和B液做1:1配制,即配即用,可根据使用量临时配制(使用前15分钟内配制),不要配制过多的显色液。
5. 1×洗涤液配制:用蒸馏水1:20倍稀释(示例:1mL 20×浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水);
操作步骤:
样本,细胞上清,细胞裂解液,脑脊液,以及其他生物学样本均需要在正式实验前预实验确认稀释倍数;血清样本一般情况下建议按照50μL 上样。
酶标板是12*8wells的lockwell 形式,属于单孔可折形式,可以按照自己的需要每次拆下相应的板条来进行实验;如果第一次使用biotnt的这款试剂盒,建议您在进行大批量实验之前先进行预实验;
预实验方式:选用1条酶标板,加入标准品1600pg/ml ,25pg/ml,0孔;另外,再选择您待测的两个样本,第一个样本选择三个稀释梯度;第二个样本选择两个稀释梯度来进行预实验;
实验步骤:
1. 加样:加入相对应标准品100μL,加入待测样品50μL、稀释液I 50ul(样本已经稀释2倍回归计算时需乘以稀释倍数2), 封板,充分混匀,室温温育60分钟;
2. 洗板:用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次,在吸水纸上拍干;
3. 每孔加入已稀释1×检测抗体 –HRP 结合物100μL,封板,室温温育60分钟;
4. 洗板:同第二步;
5. 每孔加入已配制的显色工作液100μL,将反应板置暗处室温5-15分钟,每隔一段时间,目测标准品和样本的板孔变为蓝色, 酶标仪620-630nm 进行读数并保存(第一次数据),标准品孔的最高点读数OD 值如果超过0.8,请及早终止。如果标准品最高点读数没有超过0.4,可以延长室温温育时间为30min,再进行下一步终止反应。
6. 每孔加入100μL终止液,混匀;如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻叩击板框,充分混匀。
7. 在5分钟内进行酶标仪读数,设置双波读数(第二次数据),酶标仪主波长450nm,副波长620-630nm检测吸光度。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去 620-630 nm 的测定值。仅使用450 nm 测定会导致OD值偏高,并且准确度降低。
8. 如果酶标仪没有620-630nm的波长,也可以根据酶标仪的情况选择570-650nm的波长作为替代。
结果计算与判断:
1. 所有OD值都应减除空白值后再计算;先计算450-630nm的数据(第二次数据);
2. 以标准品1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 0pg/mL为横坐标,450-630nm的OD值为纵坐标,画出标准曲线。
3. 根据样本OD值在该曲线图上查出相对应Human MCP-3含量,如样本有稀释,请再乘上稀释倍数。如果样本没有进行预稀释,则稀释倍数为2 。计算出的数值应该乘以2。
4. 推荐采用双对数方式进行数据拟合。如下是示例数据:
| Standard (pg/mL) | O.D. (450 nm-630nm) | Mean | Zero Standard Subtracted (Std.)-(S1) |
| 1600pg/ml | 2.198,2.202 | 2.200 | 2.136 |
| 800pg/ml | 1.169,1.173 | 1.171 | 1.107 |
| 400pg/ml | 0.641,0.647 | 0.644 | 0.580 |
| 200pg/ml | 0.329,0.332 | 0.331 | 0.267 |
| 100pg/ml | 0.177,0.18 | 0.179 | 0.115 |
| 50pg/ml | 0.113,0.118 | 0.116 | 0.052 |
| 25pg/ml | 0.086,0.09 | 0.088 | 0.024 |
| 0pg/ml | 0.061,0.066 | 0.064 | 0.000 |

试剂盒数据批内差(Intra-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在同一次验证实验中加样20孔,来验证批内差,检测结果如下:
| Sample | 1 | 2 | 3 |
| N | 20 | 20 | 20 |
| Mean (pg/mL) | 54.07 | 533.5 | 1067.38 |
| SD(pg/mL) | 3.29 | 28.92 | 27.97 |
| CV (%) | 6.08 | 5.42 | 2.62 |
试剂盒数据批间差(Inter-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在10次不同的实验中进行检测,来验证批间差,检测结果如下:
| Sample | 1 | 2 | 3 |
| N | 10 | 10 | 10 |
| Mean (pg/mL) | 55.72 | 536.85 | 1068.58 |
| SD(pg/ml) | 4.14 | 42.57 | 54.28 |
| CV (%) | 7.43 | 7.93 | 5.08 |
试剂盒灵敏度(Sensitivity):
本试剂盒检测Human MCP-3的最低浓度为8.33pg/mL,验证实验选取两条标准品进行梯度稀释确认8.33pg/mL以上浓度的反应孔OD值呈正相关线性分布,Human MCP-3浓度在8.33-25pg/ml之间样本可以被检测到但会有较大偏差,低于8.33pg/mL无法被检出。
试剂盒数据回归性(Recovery):
选取血清、血浆、细胞上清等不同类型的人样本按低浓度、中浓度、高浓度分组稀释做回归性验证实验,将线性回归后的浓度值与理论浓度值相比较统计结果如下:
| 样本类型 | Average Recovery% | 范围% |
| 血清 | 103 | 101-105 |
| 血浆 | 100 | 99-101 |
| 细胞上清 | 99 | 95-103 |
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