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非洲猪瘟单抗制备实验进程
1、免疫时间计划表
| 实验进程 |
日期 |
| 初免 |
2021.03.26 |
| 二免 |
2021.04.02 |
| 三免 |
2021.04.09 |
| 四免 |
2021.04.16 |
| 融合 |
2021.04.19 |
| 筛选 |
2021.04.26 |
| 亚一筛选 |
2021.05.02 |
| 亚二筛选 |
2021.05.08 |
| 亚三筛选 |
2021.05.14 |
| 腹水 |
2021.05.23 |
2、二免效价、抗体特异性
加入免疫抗体100µL /孔， 轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。再加入酶标物100µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表：
|
|
Ag 500倍 |
Ag 1k倍 |
| 1-Ab 500倍 |
4.71 |
4.28 |
| 1-Ab 5k倍 |
3.58 |
3.12 |
| 2-Ab 500倍 |
4.52 |
3.97 |
| 2-Ab 5k倍 |
2.45 |
2.01 |
| 结论 |
1、Ag包被浓度为3K倍。 |
|
| 2、二免效价较高。 |
||
3、筛选效价
3.1 筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图：
结论：共选62个阳性孔的细胞进行抗体特异性测定。
3.2 筛选抗体特异性
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。结果见下图：
结论：共选出14株效价高、抗体特异性好的细胞进行第一次亚克隆。
株号有：2C4 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2
5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10
1、亚一筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论：共选出10株效价高的细胞进行第二次亚克隆。
株号有：2C4 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10
1、亚二筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论：经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（5D2 5D4 5D7 3F10）扩大并冻存； 有六株细胞细胞进行第三次亚克隆。
三次亚克隆株号有：2C4 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10
1、亚三筛选效价
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结论：经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（8G10 2C4 4F4 7D4 ）扩大并冻存；
4F10和3D6株细胞转阴性，扔之。
7.腹水效价
将筛选到的非洲猪瘟8株单抗，制备腹水并测腹水效价。
加入酶标物50µL /孔， 再加入稀释后的抗体50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表：
| 细胞株 |
Ab-5w |
Ab-10W |
效价 |
| 2C4 |
3.98 |
3.17 |
>10w |
| 3F10 |
3.29 |
1.63 |
>10w |
| 4F4 |
3.54 |
1.55 |
>10w |
| 5D2 |
4.37 |
2.11 |
>10w |
| 5D4 |
3.54 |
1.62 |
>10w |
| 5D7 |
3.96 |
1.91 |
>10w |
| 7D4 |
4.19 |
2.54 |
>10w |
| 8G10 |
1.36 |
0.84 |
10w |
| 结论 |
非洲猪瘟筛选到8株单克隆抗体，腹水效价10w以上。 |
||
非洲猪瘟单抗配对初步测试
ASFV共8株Ab，各按生产条件标记1条金垫后测试结果
标记：1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4 6号.7D4 7号.8G10 8号.混合 9号.兔多抗
划线：用9株Ab同时划9种T线，1/1稀释.稀释液是动物CB液
（一） 金垫标记：1-8号单抗；T线：兔多抗划线1:1（动物包被液稀释）；
最初先用 1-8号金条和兔多抗1：1 划线测试阳性病料（1:5，用2*样稀稀释，非处理样品垫），如图1，8-10分观察，结论：爬速过快，需要调整爬速。
结论如下表：
1-8号金条与兔多抗1：1 测试阳性结果
|
|
1号金垫 |
2号金垫 |
3号金垫 |
4号金垫 |
5号金垫 |
6号金垫 |
7号金垫 |
8号金垫 |
| 划线兔多抗1：1 |
+ |
+ |
+- |
+ |
++ |
- |
- |
+ |
继续优化实验方案，用 1-8号金条和兔多抗1：1 分别测试阳性病料（1:5，用1*样稀稀释，用滤血膜）和猪阴性血清（1:5，用1*样稀稀释），8-10分观察，分别如图3和图4
多次实验结论：1,2,3,4,5,8,号抗体与兔多抗（1：1）反应，6,7号抗体与兔多抗（1：1）无反应。并重复复核实验1,2,3,4,5,8,这六种抗体与兔多抗的反应，如图5，证明结论正确。
（二） 颠倒测试，金垫标记：9号兔多抗标记；T线：1，2，3,4,5,8号单抗1：1（动物包被液稀释）；
阳性见图6，阴性见图7。 结论1,2号抗体最好。
9号兔多抗标记金条与1，2，3,4,5,8号抗体划线测试阴阳性结果
|
|
|
1号Ab划线 |
2号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
| 兔多抗标记的金垫 |
阳性 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
| 阴性 |
+--- |
+--- |
+-- |
+- |
+- |
+-
|
（二） 对摸索到的六株单抗进行交叉配对测试（1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4 8号.混合）
（1）1号抗体标记金条，依次为2 3 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图8.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图9
|
|
|
2号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
| 1号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+- |
+ |
+ |
+ |
+ |
| 阴性 |
+-- |
+- |
+-- |
+-- |
+-- |
（3）3号抗体标记金条，依次为1 2 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图12.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图13
|
|
|
1号Ab划线 |
2号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
| 3号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+ |
+ |
++ |
+ |
++ |
| 阴性 |
+-- |
+-- |
+-- |
+-- |
+-
|
（4）4号抗体标记金条，依次为1 2 3 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见图14.测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见图15
|
|
|
1号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
8号Ab划线 |
| 2号抗体标记的金垫 |
阳性 |
+- |
++ |
+ |
+ |
++ |
| 阴性 |
+-- |
+-- |
+- |
+-- |
+- |
|
|
|
1号Ab划线 |
2号Ab划线 |
3号Ab划线 |
4号Ab划线 |
5号Ab划线 |
| 8号抗体标记的金垫 |
阳性 |
++ |
+ |
++ |
+ |
+ |
| 阴性 |
+-- |
+-- |
+- |
+-- |
+- |
结论：经重复观察实验，以下四组单抗交叉配对效果较好。
2号抗体（3F10）标记配对3号抗体（4F4 ）划线
2号抗体（3F10）标记配对8号抗体（8株混合后）划线
3号抗体（4F4 ）标记配对4号抗体（5D2）划线
3号抗体（4F4 ）标记配对8号抗体（8株混合后）划线
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文献和实验对照组织样品对于开发信息丰富的多重荧光免疫组化检测方法至关重要。同样，与免疫学家和疾病专家合作可以帮助识别和寻找这些组织。通过在阳性和阴性细胞系、细胞沉淀和组织对照上测试单个抗体，建立初步抗体特异性。初始检查可使用更高通量的免疫测定方法，例如蛋白印迹或免疫组化（IHC）。通过检测一系列正常和病患组织进一步建立特异性[2]。 对作为感兴趣的靶标同一蛋白家族中的其他蛋白进行正交验证和抗体交叉反应测试可帮助识别抗体直接效果。通过测试在不同表达水平目标靶标的细胞系来建立抗体敏感性。有时，通过抗体克隆池（通常具有非重叠表位
排出，大约70%的气体通过供氧滤板重新进入操作区。为补充排气口排出的空气，同体积的空气通过操作口从房间空气中得到补充。这些空气绝对不会进入操作区，只是形成一个空气屏障。国产的超净工作台许多只有供气滤板，过滤空气进入操作区形成一定的正压，空气从设置的排气孔和操作口排出进入环境空气中，这种空气流动方式对周围环境和操作者都没有保护作用。（二） 调试所在的超净工作台出厂前都经过严格的测试，以保证正常的使用。但这并不是说，厂家的测试就能代替操作者使用前作必要的检验和调试。因为超净工作台所处的环境各异
5、本系统中所有信号的传输都采用USB接口。 6、本刺激系统适合不同大小的动物 二、 实验方法 生物秀模式生物与实验动物论坛 分为训练和测试两阶段 （一）训练阶段（第一天） 1．调试 仪器 ，以确保格栅地板有电流刺激，扩音器有声音刺激，并分别记录电流强度和声音强度（分贝）。 2．将大鼠放入条件恐惧箱2min（A相），记录这最初2min内动物的凝滞
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