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文献和实验流动相使用了缓冲盐,则必为反相柱(不可长时间用水冲),一般可冲20-30min,然后加入有机相(如甲醇),浓度逐步加大,直至100%甲醇; 14.反相和正相转换时,一般要做溶剂过渡(最佳为异丙醇),因为粘度大,流速不可设太大,不要超过1ml/min(完全置换原来溶剂所需溶剂体积=体系体积(柱体积+1.5ml)×5); 15.比例阀内漏:抬起有嫌疑的通路,看管内流动相体积是否减少(抬起时同时打开purge阀); 16.泵压力不正常可能原因:气泡、主动阀故障、出口阀
)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS ( PH7.2-7.4 )稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS , PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃ 的温度。加入一定量的 PBS ( PH7.4 ),用手工或匀浆器将标本匀浆
mM Gly-NaOH(pH 9~12),所有缓冲液均为 25℃ 下配制。底物在 25℃ 温浴 10 分钟后,开始测活。 2. pH 稳定性的研究 取活性为 10 mg/ml 纯酶液,分别在 pH 3~12 缓冲液中稀释 10 倍,在 25℃ 下温浴 2 h,取样品测定酶活,以水浴前酶液初始活性作为 100%,计算残余活性。缓冲液依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6),25 mM Tris-HCl (pH 7~8),25 mM Gly-NaOH (pH 9~12),所有缓冲
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