牛细胞粘附蛋白相互作用蛋白(CYTIP) ELISA 试剂盒

                                

牛细胞粘附蛋白相互作用蛋白(CYTIP) ELISA 试剂盒

一、实验原理

 ELISA 试剂盒ELISA试剂盒是一种基于酶联免疫吸附法（ELISA）的试剂盒，用于定量检测人血清、血浆或组织匀浆中的 浓度。本试剂盒采用高特异性的抗体捕获抗原，并通过酶标板检测系统进行定量分析。本实验将详细介绍该试剂盒的操作步骤。

 

1、效价
      放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质符号抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。一般以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清自身的性质决议外，还受符号抗原的质量、孵育时刻，所用稀释液的成分及其pH等要素的影响，在工作中有必要引起留意。
       双向分散法：使用大分子抗原和抗体在琼脂平板上分散，两者在相交处发生沉积线，以调查和判别抗血清中是否有抗体及其浓度。
球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂彻底溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，参加，使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在洁净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，彻底凝固后，用打孔器打孔。中心孔内加适量抗原，周围各孔内分别参加50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，调查有无沉积线发生，以判别血清的稀释度。

2. 特异性测定
     抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的辨认能力。特异性好就是抗血清的辨认能力强。一般，特异性是以穿插反响率来表明的。穿插反响率低，表明抗血清的特异性好，反之则特异性差。穿插反响率一般是用竞赛按捺曲线来判别的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞赛按捺曲线，核算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式核算穿插反响率。
       S=y/Z×100%
    S：穿插反响率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。
如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，能够说这一抗血清与其它抗原物质的穿插反响率近似零，即无穿插反响，该抗血清的特异性是好的。

3. 亲合力
     在免疫学中，亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或结实度。抗体与抗原结合疏松，结合后会敏捷解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的凹凸是由抗原分子的巨细，抗体分子的结合位点与抗原的决议基之间的立体结构型的适宜程度决议的。亲合力常以亲合常数K表明。K的单位是升/摩尔。在RIA中，K是该抗血清能到达的最小检出量的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，一般，K的范围在108～1012L/mol之间，也有高达1014L/mol的。
核算亲合常数的办法20余种，核算出的K都不能实在反映试验状况，只能作为参阅。

 

 

冷冻细胞冻结程序:

2.1. 根据细胞株数据单指定之基础培育基品种、血清品种和其它指定之成份和份额，制备培育基。绝大多数之细胞均无法当即习惯不同之基础培育基或不同之血清品种，若因试验需要，有必要有所不同时，必须以缓慢份额逐步改动培育基组成，断定细胞习惯后，方进行所需之试验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请必须根据细胞株资料单指定之血清品种培育之。

将培育基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦洗之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，当即放入37 °C 水槽中快速冻结，水面高度不行挨近或高过冷冻管之盖沿，不然易发作污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，以70 % ethanol 擦洗冷冻管外部，移入无菌操作台内。

根据细胞品种和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培育基加至T25 或T75 flask中。取出已冻结之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培育基，混合均匀，放入37 °C，5 % CO2 培育箱培育。

 

四、结果分析

根据标准品和样本的OD值，绘制标准曲线，从而计算出样本中兔转铁蛋白受体(TFR/CD71) 的浓度。具体分析方法可参考试剂盒说明书或相关文献。

 

五、注意事项

1. 在操作过程中，应保持酶标板的干燥，避免水分进入孔内。
2. 加样时需确保加样准确、无气泡产生。
3. 温育和洗涤过程中需严格控制时间和温度，确保实验结果的准确性。
4. 在使用酶标仪读取OD值时，需确保波长设置正确，避免误差产生。
5. 在整个实验过程中，需保持操作环境的清洁和整洁，避免交叉污染。

如何处理ELISA测定抗体疫苗之实验数据

在ELISA试剂盒试验中我们总是碰到许多关于数据处理的难题，为了能我们更多更具体的了解在试验中数据处理的问题，下面一起来看看ELISA测定抗体之怎么处理试验数据。

ELISA做得很好的话批间CV都要有10～15％左右，用同一个抗原，但对于包被的抗原浓度对OD的影响不是很大，只要不是不同太大即可。抗血清当然要用同一个稀释度了。别的比较的话就必每批，每块板上的样品都要伴随着一个参比品一同做，参比品仍是同一个这样才干确保试验成果的可比性。

剖析：

（1）将同一只动物免疫不同时刻后抗体产生的效价进行比较。

（2）由上面能够得出一组数据，举个比如即如某个免疫间期抗体升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多数情况下可升高多少，即此种升高率的阳性率，然后再用泊松散布证明此阳性率是否赞同整体在这个免疫间期增高的阳性率，仍是由于随机误差的原因使试验得到了这个成果。

（3）计算出不同间期的效价水平后，能够用方差剖析进行整体比较，证明不同间期免疫的作用差异是否有计算学含义；然后再两两之间进行比较，看免疫作用*显着的是哪个间期。

怎样体现试验成果？

1、文字叙说：依据试验意图将原始资料系统化、条理化，用精确的专业术语客观地描绘试验现象和成果，要有时刻次序以及各项目标在时刻上的联系。

2、图表：用表格或坐标图的方法使试验成果杰出、明晰，便于彼此比较，尤其适合于分组较多，且各组调查目标一致的试验，使组间异同一望而知。每一图表应有表目和计量单位，应阐明必定的中心问题。

3、曲线图：使用记载仪器描记出的曲线图，这些目标的变化趋势形象生动、直观明了。在试验陈述中，可任选其间一种或几种办法并用，以取得最佳作用。

ELISA实验的加样原理是什么？
  ELISA是免疫学中常用检测办法，在ELISA试验进程中加样也是极为重要的步骤之一。今日，酶联生物将为广大科研朋友解说ELISA试剂盒试验加样的原理，以供咱们参阅：
正确的加样办法应为45度，吸头贴着孔壁参加，应留意视点太小，会使液体残留在孔壁上，导致加样不精确；吸头应当贴着管壁和液面的交界处！
要留意防止呈现严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有相似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育进程中吸附于固相，然后与后边参加的HRP底物反响显色。
血清标本如是以无菌操作别离，则可以在2～8 ℃下保存一周，如为有菌操作，则主张冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70 ℃以下。样本的收集及血清别离中要留意尽量防止细菌污染，一则细菌的成长，其所排泄的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白发生分化效果；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定办法发生非特异性干扰。标本在保存中如呈现细菌污染所形成的的混浊或絮状物时，应离心沉积后取上清检测。冰冻保存的血清标本须留意防止因停电等形成的重复冻融。标本的重复冻融所发生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子发生损坏效果，然后引起假阴性成果。此外，冻融标本的混匀亦应留意，不要进行剧烈振动，重复倒置混匀即可。

 

牛细胞粘附蛋白相互作用蛋白(CYTIP) ELISA 试剂盒

 

ELISA试剂盒运用应当留心哪些事项

1、ELISA试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可运用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2、浓洗刷液可能会有结晶分出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗刷时不影响效果。

3、各步加样均应运用加样器，并常常校正其准确性，以避免实验过失。一次加样时刻最好控制在5分钟内，如标本数量多，举荐运用排枪加样。

4、请每次测定的一同做规范曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于规范品孔榜首孔OD值的)，请先用样品稀释液稀释必定倍数(n倍)后再测定，核算时请最终乘以总稀释倍数(×n×5)。

5、严格按说明书的操作进行，ELISA试剂盒效果判定有必要以酶标仪读数为准.

6、本试剂不同批号组分不得混用。

7、封板膜只限一次性运用，以避免穿插污染。

8、悉数样品，洗刷液和各种废弃物都应按感染物处理。

9、底物请避光保存。

 

血清在动物细胞培养中起的作用

A 供应细胞生计和增殖所必需的生长调理因子。

B 补偿根底培养基中没有或量缺少的营养成分。

C 富含一些可供贴壁细胞型细胞贴壁生长的基质成分。

D 供应载体蛋白，可联络维生素、脂质、金属离子等。

E 在一些情况下，中和毒性物质维护细胞不受损害。

F 给培养液供应出色的缓冲系统。

G 供应蛋白酶克制剂，维护细胞免受死细胞开释的蛋白酶的损害。

血清也存在一些害处，比如存在不少有害成分（补体、免疫球蛋白和一些生长克制因子等）；血清成分不明确，影响对效果的分析；不一样动物、不一样批次的血清成分和活性有很大不一样，使得培养效果不稳定。尽管如此，血清仍然是培养液中最根本的添加物，尤其是在原代培养或细胞生长情况不良时，常常会先运用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛后再换成无血清培养液。

血清中富含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其间蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞组成蛋白质的根本成分，其间有些氨基酸动物细胞本身不能组成（称为必需氨基酸），必须由培养液供应。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还富含多种不知道的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能推进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞可以顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清，动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。

抗体技术规格

Background:	Adapter protein which acts downstream of several membrane receptors including cytokine, antigen, hormone, cell matrix and growth factor receptors to regulate multiple signaling pathways. Regulates osteoclast differentiation mediating the TNFRSF11A/RANK signaling. In allergic response, it plays a role in mast cells activation and degranulation through PI-3-kinase regulation. Also involved in the regulation of cell proliferation and hematopoiesis.
Applications:	WB
Name of antibody:	GAB2(Ab-623)
Immunogen:	Synthesized non-phosphopeptide derived from human Gab2 around the phosphorylation site of serine 623 (P-S-S(p)-P-S).
Full name:	GRB2-associated binding protein 2
Synonyms：	KIAA0571
SwissProt:	Q9UQC2
WB Predicted band size:	74 kDa
WB Positive control:	COS cells lysate
WB Recommended dilution:	500-3000