大肠杆菌（E.coli）宿主蛋白（HCP）残留检测试剂盒

一、背景介绍

大肠杆菌（E.coli）宿主蛋白（HCP）残留检测试剂盒是用来定量分析以大肠杆菌（E.coli）为表达系统时，蛋白药物中宿主细胞残留蛋白。 大肠杆菌被广泛用来作为表达系统，在破碎菌体提取目标蛋白过程中，很大一部分宿主蛋白与目的蛋白一起释放，该宿主蛋白具有很强的免疫原性，导致不良的毒性或免疫反应而危及产品安全和质量，造成潜在的生物污染，生物医药产品生产下游过程的目的之一就是移除这些潜在危害。因此，非常有必要将宿主细胞蛋白（HCP）残留量降低到最低水平，在研发下游纯化的工艺时，必须具有一种科学合理的测定成品或者半成品中HCP浓度的方法，而酶联免疫法具有极高灵敏度，因而被监管机构定为HCP检测的金标准。

二、实验原理

本试剂盒采用了固相夹心法的酶联免疫吸附实验（ELISA）。先将捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体。检测时在包被抗体的微孔板中先加入待测抗原孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，形成包被抗体-抗原-检测抗体复合物。经洗涤后去除未参与反应的结合物，最后加入底物TMB显色。TMB在HRP的氧化作用下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。氧化后的TMB颜色和因子的总含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与浓度拟合成标准曲线，通过样本OD值，代入标准曲线方程，计算样品中因子浓度。

三、试剂盒优势

(1) 覆盖度广：包被抗体及检测抗体均为种属兔来源，有较强的识别HCP能力，且该种属个体间差异小，具有高度可比性，工艺稳定。

(2) 抗体滴度高：试剂盒中使用的抗体，间接法Elisa检测抗血清效价达106。

(3) 灵敏度高：血清抗体纯化采用亲和纯化，最大限度去除非特异性抗体。

(4) 稳定性高：生产过程采用广谱蛋白稳定剂，和微孔板处理工艺，增加标准品及微孔板热稳定性和结果的可重复性。

(5) 稀释液优化：使用优化稀释液，可降低样本检测过程中非特异性吸附，本底显色极低利于观察待测样本浓度。

四、实验材料及仪器准备

1. 试剂盒内容（2-8℃冷藏）

	名称	规格	数量	保存
1	已包被平底微孔板	96孔	1板（可拆卸）	2-8℃密封冷藏
2	标准品母液（10ug/ml）	100ul	1管	2-8℃冷藏
3	检测抗体母液(100×)	150ul	1管	2-8℃冷藏
4	TMB	10ml	1瓶	2-8℃避光冷藏
5	终止液	10ml	1瓶	2-8℃冷藏
6	洗液（100X）	10ml	1瓶	2-8℃冷藏
7	稀释液（10X）	10ml	1瓶	2-8℃冷藏
8	稀释液组分	0.5g	1管	2-8℃冷藏
9	封板膜		4张
10	使用说明书		1份

五、实验需要但试剂盒未提供的材料 

1) 10-1000μl移液器及一次性灭菌吸头

2) 多道移液器

3) 灭菌的去离子水或超纯水1L

4) 灭菌EP管

5) 吸水纸

6) 酶标仪

7) 高速离心机

8) 洗板机或者洗瓶

9) 数据分析及绘图软件

样本准备注意事项：

u 样本收集完毕后，要分装保存在-20°C (少于3个月) 或-80°C (少于6个月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反复冻融，如果要在24小时内分析样本，可以保存在2- 8°C。

u 某些化学裂解液可能会对本实验造成干扰，比如SDS，Triton，谨慎使用。

u 样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰，务必离心去除。

u 不能加热来融化样本。

七、实验前的准备

请仔细阅读试剂盒说明书，反应在室温下进行。

八、试剂的准备

1) 试剂盒内所有试剂及包被板，请在使用前的30min拿出，使其恢复室温。

2) 洗液的稀释：将10ml 100×洗液母液，加入990ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。

3) 稀释液的准备：将10ml 10×稀释液母液，加入90ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。将含量为0.5g的稀释液组分全部加入到100ml的1X稀释液中，溶解并混匀，用作标准品，样品，检测抗体的稀释液。

九、注意事项

应用：定量检测蛋白纯化过程及终产物中宿主细胞蛋白残留

用途：本试剂盒仅供科研使用，不得用于临床及诊断使用！