200856-100安捷伦Agilent微孔板盖,通用盖，P

【交流】载体构建的一点心得

这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种；有单片段酶切插入这种不用脑型的，也有九个片段逐一插入正反向还不同的。专家不敢说，但是熟能生巧，确实积累了不少经验，现在系里从POSTDOC到PHD学生到TECH构建前很多

【资源】【献给初学者】western blot操作步骤2012版

忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。 二、蛋白质定量 如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug

献给初学者：western blot操作步骤2012版

进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。 二、蛋白质定量 如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白