牛核孔蛋白62KDa(NUP62) ELISA 试剂盒

牛核孔蛋白62KDa(NUP62) ELISA 试剂盒 
供体外研究使用，不用于临床诊断!
有效期：6个月

保存条件：2-8℃


[实验原理]
    试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠（Acetyl-Foxo3a）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。


[样本处理及要求]
1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.  组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。



[需要而未提供的试剂和器材]
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
4.蒸馏水或去离子水



[试剂盒组成]



备注：
1.  标准品浓度依次为：600、300、150、75、37.5、18.75 ng/mL
2.  经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。



[注意事项]
1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6.在储存和温育时避免强光直接照射。
7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9.不能使用过期产品。
10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。



[试剂准备]
从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。



[操作步骤]
1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.  样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。



[实验结果计算]
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。



[试剂盒性能]
1. 检测范围：18.75 ng/mL – 600 ng/mL。
2. 灵敏度：最低检测浓度小于1.0 ng/mL。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。



[说明]
1.由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。
2.最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。
3.不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书仅作参考。
4.只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到最佳的检测结果。
5.本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。
6.使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。
7.若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。
8.某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。

牛核孔蛋白62KDa(NUP62) ELISA 试剂盒 
ELISA检测试剂盒承诺
公司长期与各大高校、医院及权威科研单位保持着良好的合作关系，公司的产品质量及服务态度得到了他们的一致认可。笃玛生物本着客户至上的原则为客户提供优质产品，公司承诺产品有任何质量的问题免费包退换（非人为因素造成的）。公司提供免费代测服务，并且承诺收到样本七个工作日出结果，确保数据的准确性。


试验原理：
本试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水；
（7）酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的*终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

 
自备材料
1）蒸馏水。
2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振荡器及磁力搅拌器等。
 
试剂盒安全性
1）避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

制取抗体应采用什么方法原理？
抗体也是有着多种类型及不同种属的，制取抗体应选用什么办法原理？
免疫细胞化学的技能要害之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决议簇，用它免疫动物将发生对各个决议簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决议簇的，因而特异性强，亲合性也共同。



怎么挑选正确的抗体制备技能？
从别离到表达：不同的抗体重组技能能够用于制备不同的抗体，工业上和学术界都开展了许多相关的技能，噬菌体展现就是其间的主导技能。昆虫和哺乳动物细胞的表达体系从理论上而言是类似的，可是其它的分子进化类型需求从头提炼和别离抗体。
（抗血清质量的评价）
1. 效价
放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质符号抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。一般以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清自身的性质决议外，还受符号抗原的质量、孵育时刻，所用稀释液的成分及其pH等要素的影响，在工作中有必要引起留意。
双向分散法：使用大分子抗原和抗体在琼脂平板上分散，两者在相交处发生沉积线，以调查和判别抗血清中是否有抗体及其浓度。
球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂彻底溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，参加，使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在洁净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，彻底凝固后，用打孔器打孔。中心孔内加适量抗原，周围各孔内分别参加50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，调查有无沉积线发生，以判别血清的稀释度。

 
2. 特异性测定
     抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的辨认能力。特异性好就是抗血清的辨认能力强。一般，特异性是以穿插反响率来表明的。穿插反响率低，表明抗血清的特异性好，反之则特异性差。穿插反响率一般是用竞赛按捺曲线来判别的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞赛按捺曲线，核算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式核算穿插反响率。
S=y/Z×100%
S：穿插反响率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。
如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，能够说这一抗血清与其它抗原物质的穿插反响率近似零，即无穿插反响，该抗血清的特异性是好的。

3. 亲合力
     在免疫学中，亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或结实度。抗体与抗原结合疏松，结合后会敏捷解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的凹凸是由抗原分子的巨细，抗体分子的结合位点与抗原的决议基之间的立体结构型的适宜程度决议的。亲合力常以亲合常数K表明。K的单位是升/摩尔。在RIA中，K是该抗血清能到达的最小检出量的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，一般，K的范围在108～1012L/mol之间，也有高达1014L/mol的。
     核算亲合常数的办法20余种，核算出的K都不能实在反映试验状况，只能作为参阅。
 
试剂盒局限
6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

试剂盒试剂盒性能
1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性：不与其它细胞因子反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。
 
冷冻细胞冻结程序

 
ELISA检测试剂盒承诺
公司长期与各大高校、医院及权威科研单位保持着良好的合作关系，公司的产品质量及服务态度得到了他们的一致认可。笃玛生物本着客户至上的原则为客户提供优质产品，公司承诺产品有任何质量的问题免费包退换（非人为因素造成的）。公司提供免费代测服务，并且承诺收到样本七个工作日出结果，确保数据的准确性。