牛I类主要组织相容性复合体E(MHCE/HLA--E) EL

牛I类主要组织相容性复合体E(MHCE/HLA--E) ELISA 试剂盒

 

ELISA的评估

ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：

1、准确性

ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：

 

 

a.回收率：测定试剂盒对数据真实性的校准，过高或偏低会产生加样和假性性的失准数据。
b.线性：测定试剂盒稀释液与样本微环境的的准确性，过高或偏低均会出现测定的偏差。

 

2、精确度

a.板内精确度：评价单次实验中，同一个已知浓度不同复孔的差异。
b.板间精确度：评价同一样本，多次实验的差异。

 

3、精密度

检测限：能显著区分空白信号的最小信号值对应的浓度，用于评估试剂盒的灵敏度，值越低试剂盒灵敏度越高。

 

4、特异性

a.交叉反应：评判特异性，不同分子与试剂盒抗体结合能力，交叉反应越大，特异性越差。
b.抗干扰能力：同源物的干扰，内源性物质对检测系统的干扰。

 

5.天然样本检测性

对天然样本及合适的样本类型检测分析。对天然样本类型确定，避免假阳性或假阴性结果。

 

6、稳定性

试剂盒时效性和稳定性是对指标检测的重要保障。稳定性越高，试剂盒存储时间越久。

 

 

 

 

ELISA的原理

ELISA原理是将抗原或抗体包被在固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，检测过程中，通常使用洗板的方式去除非结合物，最终酶促反应后的底物的颜色，对样本中蛋白进行定性与定量。

 

不按说明书操作会造成的后果

每一个试剂盒里都会有对应的说明书，注意事项里大多都会提到“实验严格按照说明书的操作进行”。为什么要严格按照说明书操作？为了更完整的回答这个问题，需要先回顾一下ELISA各种方法的原理。

根据试剂的来源和标本的性状及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法。大致分为以下几类：

1.双抗体夹心法测抗原

2.双抗原夹心法测抗体

3.竞争法测抗原

4.间接法测抗体

 

总结如果不按说明书操作可能会出现的不满意结果。

 

A. 先说最严重的操作错误，看错或压根不看试剂盒配套说明书，不按操作步骤加样。比如把竞争法的试剂盒当作双抗体夹心法来做，导致的结果就是整板显示很强的蓝色，无任何梯度。

 

 

B. 混用别的试剂盒里的试剂。不同厂家或者相同厂家的不同试剂盒，所含的试剂成分很可能是不一样的，混用导致的结果是，浪费珍贵的样本，样品的回收率达不到预期值，如果混用不同试剂盒的酶复合物，会导致显色过弱或过强，因为每种试剂盒所用酶复合物效价可能不一样。

 

C. 不看文献或者不做预实验。比如某个试剂盒按照其灵敏度范围和文献报道推算样本应该1:10稀释，结果稀释成1:1000，导致的结果是显色过弱，结果不可用。

 

D. 不校准移液器及培养箱的温度湿度。导致工作试剂浓度不准确，孵育温度不合适，实验带来误差。

 

E. 洗涤不充分，每孔洗液加样过少，或者残留。导致的结果是显色过快，同时背景较高。

 

F. 手洗板时所用枪头没有悬空加入洗液，导致洗液污染，整个实验失败。

 

G. 剩余酶标板条未及时放入干燥袋，导致酶标板受潮，下一次再做时，显色过弱或污染，CV值过高。

 

  ELISA常见主要试剂

1. 抗体：单抗特异性强，多抗结合性高，试剂盒需要高效的配对。

2. 2.抗原：大多为重组蛋白,细胞因子和待测样本，高效标准品需NIBSC/WHO校准。

3. 3.显色作用体系：首先辣根过氧化物酶（HRP）与常见底物TMB和OPD均可形成显色体系，再者碱性磷酸酶(AP)的底物为对-磷酸酯可形成黄色底物，还有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊显色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物为4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高强度荧光。

 

ELISA的类型

根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，按照原理及操作，市面的方法有：

 

  1.间接法ELISA

是检测抗体的方法，原理为利用酶标记的二抗以检测已与固相结合的受检抗体，显色测定。优势在于待测一抗无需标记快速便捷。直接法ELISA与间接法ELISA相似，区别在于一抗酶标，检测孵育也以抗原为主，但直接法ELISA的灵敏度有限，需权衡使用。

 

2.夹心法ELISA

又分为双抗原夹心法和双抗体夹心法ELISA，原理相似，用于检测抗体或抗原含量。以双抗体夹心法为例，捕获抗体包被在固相载体上，加入抗原或待测样本结合，后加入的检测抗体结合在抗原上，形成三明治夹心形式。双抗夹心法是市面最常见与方便分析的方法。

3.竞争法ELISA

小分子抗原与半抗原的检测方法常用竞争法ELISA，待检样本中抗原越多，被结合的酶标抗原的量会减少，彼此形成竞争负相关体系，显色物质也就越少，根据显色物质的比例可拟合得到待测抗原含量。

4.其他方法

a.免疫抑制法测ELISA：固相包被抗原，被检样本对底物显色的抑制程度与样本中所含抗原的量成正比，二者之差为待测抗原含量，原理类似与竞争法ELISA。

b.阻断ELISA：目的检测特异性抗体，也称为竞争ELISA，原理为固相包被抗原，待测样本与一抗酶标竞争孵育，待检样本中抗体越多，显色越浅，反则反之。非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中涉及该法。

c.此外有用于检测IgM抗体的抗体捕捉ELISA，有固相载体改变的Dot-ELISA（硝酸纤维素膜）和C-ELISA（涤纶布），还有技术分类的TRFIA和多因子检测等。

ELISA的评估

ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：

  1、准确性

ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：

a.回收率：测定试剂盒对数据真实性的校准，过高或偏低会产生加样和假性性的失准数据。

b.线性：测定试剂盒稀释液与样本微环境的的准确性，过高或偏低均会出现测定的偏差。

 

  2、精确度

a.板内精确度：评价单次实验中，同一个已知浓度不同复孔的差异。

b.板间精确度：评价同一样本，多次实验的差异。

 

 3、精密度

检测限：能显著区分空白信号的最小信号值对应的浓度，用于评估试剂盒的灵敏度，值越低试剂盒灵敏度越高。

 

  4、特异性

a.交叉反应：评判特异性，不同分子与试剂盒抗体结合能力，交叉反应越大，特异性越差。

b.抗干扰能力：同源物的干扰，内源性物质对检测系统的干扰。

 

  5.天然样本检测性

对天然样本及合适的样本类型检测分析。对天然样本类型确定，避免假阳性或假阴性结果。

 

  6、稳定性

试剂盒时效性和稳定性是对指标检测的重要保障。稳定性越高，试剂盒存储时间越久。

 

ELISA的应用

ELISA技术是特定靶标蛋白质定量的金标准，提供快速，稳定且易于分析的结果。可以对生物大分子/小分子的定量，对亲和力测定评价或者筛选，还可对重组蛋白或细胞因子进行活性比对分析等运用。常应用于细胞因子，趋化因子，生长因子等检测，同时应用于癌症、干细胞、免疫学、神经学和信号转导等研究领域的靶标。

 

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离开了细胞培养皿，还能愉快做实验吗
      培育皿一般用玻璃或塑料制成，是培育微生物或细胞培育的常用试验耗材，一般玻璃的能够用于植物资料、微生物培育和动物细胞的贴壁培育也可能用到。塑料的可能是聚乙烯资料的，合适试验室接种、划线、分离细菌的操作，能够用于植物资料的培育。培育皿易碎，在清洗和运用时要当心轻拿轻放，运用完后要及时清洗洁净，存放在安全、固定的方位。

培育皿的清洁：
1、浸泡：新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿运用前得先用自来水简略冲刷，然后用5%盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有许多蛋白质和油脂，干枯后不易冲刷掉，故用后应立即浸入清水中备冲刷。
2、冲刷：将浸泡后的玻璃器皿放到洗刷剂水中，用软毛刷重复冲刷。不要留死角，并避免损坏器皿外表的光洁度。将冲刷洁净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。
3、.浸酸：浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用铲除器皿外表的可能残留物质。浸酸不该少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要当心。
4、冲刷：冲刷和浸酸后的器皿都必须用水充沛冲刷，浸酸后器皿是否冲刷的洁净，直接影响到细胞培育的胜败。手艺洗刷浸酸后的器皿，每件器皿至少要重复“灌水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

培育皿运用留意事宜：
1、运用前通过清洁消毒，培育皿清洁与否对作业影响较大，可影响培育基的酸碱度，若有某些化学药品的存在，会按捺细菌成长。
2、新购的培育皿应先用热水冲刷，再置于质量分数为1%或2%的盐酸溶液中浸泡数小时，使游离碱性物质除掉，再用蒸馏水冲刷2次。
3、若要培育细菌，再用高压蒸气(一般6.8*10的5次方Pa高压蒸气)，120℃的温度下30min灭菌，置室温中枯燥，或用干热灭菌，就是将培育皿置于烘箱内，温度控制在120℃左右的情况下保持2h，即可杀死细菌的胞牙。
4、通过消毒的培育皿才干接种培育运用。

 

 

 

 

牛I类主要组织相容性复合体E(MHCE/HLA--E) ELISA 试剂盒

AP的底物

　　AP为磷酸酯酶，一般采用对磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。

2，洗涤液

　　在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。

3，　酶反应终止液

　　常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。