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- Solarbio
- 北京
- BC5760
- 2025年07月11日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20°C
- 保质期：
6个月
- 英文名：
Malic Acid Synthase (MS) Activity Assay Kit
- 库存：
999
- 供应商：
北京索莱宝科技有限公司
- CAS号：
BC5760-50T/24S
- 规格：
50T/24S
苹果酸合酶（MS）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC5760
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
| 提取液 |
液体30 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 试剂一 |
液体40 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 试剂二 |
液体1.5 mL×1支 |
2-8℃保存 |
| 试剂三 |
粉剂×1支 |
-20℃保存 |
| 试剂四 |
液体3 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 试剂五 |
液体15 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 试剂六 |
液体3 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。
产品说明：
苹果酸合酶（Malate Synthase，EC2.3.3.9）是属于转移酶中酰基转移酶的一类，主要存在于植物和微生物中。是乙醛酸循环的关键酶之一，在MS催化下乙醛酸与乙酰辅酶A反应生成苹果酸。MS催化乙酰CoA和乙醛酸产生苹果酸，同时生成辅酶A，辅酶A使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸收峰，据此可以计算MS活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、天平、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
2. 细菌/细胞：按照细菌/细胞数量（106个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌/细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间5min）；然后12000 g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养上清等液体：直接检测，若有浑浊可以离心后取上清测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、 试剂一25℃预热15min。
3、 操作表：（在1.5mL EP管中加入下列试剂）
（1）酶促反应
| 试剂名称（μL） |
对照管 |
测定管 |
| 试剂一 |
700 |
600 |
| 试剂二 |
- |
50 |
| 试剂三 |
- |
50 |
| 样本 |
250 |
250 |
| 充分混匀，25℃反应20min |
||
| 试剂四 |
50 |
50 |
| 充分混匀，4℃ 12000g离心5min，取上清于1.5mL EP 管中。 |
||
（2）显色反应
| 试剂名称（μL） |
对照管 |
测定管 |
| 上清液 |
700 |
700 |
| 试剂五 |
250 |
250 |
| 试剂六 |
50 |
50 |
| 充分混匀静置5min，测定412nm下的吸光度，分别记为A对照、A测定。计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 |
||
三、苹果酸合酶（MS）计算公式
1. 按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（Cpr×V样）÷T×F =21×ΔA÷Cpr×F
2. 按样本质量计算：
酶活定义：25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MS活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（W÷V提取×V样）÷T×F =21×ΔA÷W×F
3. 按细菌/细胞计算：
酶活定义：25℃下每106个细菌/细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MS活性（U/106 cell）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（N÷V提取×V样）÷T×F =21×ΔA÷N×F
4. 按液体体积计算：
酶活定义：25℃下每mL液体在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
MS活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷V样÷T×F =21×ΔA÷N×F
ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光径，1cm；V显色：显色反应总体积，1mL；V上清液：显色反应中上清液体积，0.7mL；V酶促：酶促反应总体积，1mL；V样：反应体系中加入的样本体积，0.25mL；V提取：加入提取液的体积，1mL；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以106计；F：稀释倍数。
注意事项：
1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
3. 若样本ΔA<0.01，可适当增大样本量重新提取或增大加样表样本体积（可同时降低试剂一体积保证总体积不变）后测定；若样本ΔA>1.0或A测定>1.5，可用蒸馏水稀释上清液后测定，注意同步修改计算公式中的稀释倍数。
实验实例：
1、 取0.1141g霉菌加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得ΔA=A测定-A对照=0.338-0.270=0.068，按样本质量计算MS活性得：
MS活性（U/g 质量）=21×ΔA÷W×F =12.515 U/g 质量。
2、 取0.1169g萌芽的绿豆加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清后用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得ΔA=A测定-A对照=0.634-0.398=0.236，按样本质量计算MS活性得：
MS活性（U/g 质量）=21×ΔA÷W×F =84.790. U/g 质量。
3、 取0.1102g芒果加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得ΔA=A测定-A对照=0.507-0.201=0.306，按样本质量计算MS活性得：
MS活性（U/g 质量）=21×ΔA÷W×F =58.312 U/g 质量。
参考文献：
[1] Roucourt B, Minnebo N, Augustijns P, Hertveldt K, Volckaert G, Lavigne R. Biochemical characterization of malate synthase G of P. aeruginosa. BMC Biochem. 2009 Jun 24;10:20.
[2] Miernyk JA, Trelease RN, Choinski JS. Malate synthase activity in cotton and other ungerminated oilseeds: a survey. Plant Physiol. 1979 Jun;63(6):1068-71.
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