睾酮单克隆抗体；睾酮抗体；Testosterone（T）抗体

睾酮单克隆抗体；睾酮抗体；Testosterone（T）抗体；睾酮偶联抗原；睾酮抗原

Testosterone（T） Testosterone monoclonal antibody

睾酮是人体内最主要的雄激素，主要由睾丸间质细胞合成，肾上腺可分泌雄激素。

睾酮偶联抗原

一、基本概念

二、偶联原理与常用载体蛋白

（一）偶联原理

• 常用偶联位点：
  • 3 - 酮基：通过肟化反应（如与羟胺反应生成 3 - 肟基）引入羧基，再与载体蛋白的氨基偶联；
  • 17β- 羟基：通过琥珀酸酐酯化生成 17 - 琥珀酸半酯，引入羧基后与载体蛋白偶联。

（二）常用载体蛋白

三、偶联方法与操作流程

（一）试剂准备

• 睾酮（Testosterone，纯度≥98%）；
• 盐酸羟胺（NH₂OH・HCl，用于肟化 3 - 酮基）；
• 碳酸钠（Na₂CO₃）/ 碳酸氢钠（NaHCO₃）缓冲液（pH 8.5，偶联反应环境）；
• BSA（溶解于 0.01 M PBS，pH 7.4）；
• 透析袋（截留分子量 10 kDa，用于分离未偶联的小分子）。

（二）操作步骤

1. 睾酮肟化（引入羧基）
   • 将 50 mg 睾酮溶于 1 mL 无水乙醇，加入 200 mg 盐酸羟胺和 200 μL 1 M NaOH，60℃水浴反应 2 小时（肟化 3 - 酮基生成睾酮 - 3 - 肟，同时羟基可能被质子化）；
   • 冷却后用 1 M HCl 调 pH 至中性，旋转蒸发除去乙醇，得到睾酮 - 3 - 肟固体（含游离羧基）。
2. 羧基活化（EDC/NHS 法）
   • 将睾酮 - 3 - 肟溶于 DMF（二甲基甲酰胺），加入 EDC（1 - 乙基 - 3-（3 - 二甲基氨基丙基）碳二亚胺）和 NHS（N - 羟基琥珀酰亚胺），室温活化 30 分钟（形成活性酯中间体）。
3. 与 BSA 偶联
   • 将活化后的睾酮 - 3 - 肟溶液缓慢滴入 BSA 溶液（10 mg/mL，pH 8.5），室温搅拌反应 4 小时，通过酰胺键形成睾酮 - 3 - 肟 - BSA 偶联物。
4. 纯化与鉴定
   • 透析纯化：将反应液装入透析袋，用 0.01 M PBS（pH 7.4）透析 24 小时（4℃，换液 3 次），去除未偶联的睾酮和试剂；
   • 鉴定方法：
     • 紫外分光光度法：测定 BSA（280 nm）和睾酮（240 nm）的特征吸收峰，计算偶联比（通常每分子 BSA 偶联 5～20 个睾酮分子）；
     • SDS-PAGE 电泳：偶联物分子量略大于 BSA，条带迁移率略低，可初步判断偶联成功。

四、关键影响因素

1. 偶联位点与连接臂长度
   • 偶联位点会影响抗体识别的表位：
     • 3 - 肟基偶联：抗体识别睾酮分子的 A 环（3 - 酮基附近）；
     • 17 - 琥珀酸酯偶联：抗体识别 D 环（17β- 羟基附近）。
   • 连接臂过长可能增加空间位阻，过短可能导致载体蛋白掩盖睾酮表位，通常以 4～6 个碳原子的链长为宜（如琥珀酸酐引入 C4 连接臂）。
2. 载体蛋白与偶联比
   • 偶联比过低（如＜5 个睾酮 / BSA）：免疫原性不足，抗体效价低；
   • 偶联比过高（如＞30 个睾酮 / BSA）：可能导致载体蛋白构象改变，产生非特异性抗体。
3. 溶剂与反应 pH
   • 睾酮为脂溶性小分子，需用乙醇、DMF 等有机溶剂溶解，但溶剂体积需控制在总体积的 5% 以下，避免破坏蛋白结构；
   • 偶联反应 pH 需维持在弱碱性（pH 8.0～9.0），以促进载体蛋白氨基（-NH₂）的解离和反应活性。

五、应用场景

1. 抗体制备（核心用途）
   • 多克隆抗体：用睾酮 - BSA 偶联抗原免疫动物（如兔子），制备抗血清，用于检测睾酮或研究其生物学功能；
   • 单克隆抗体：用睾酮 - KLH 偶联抗原免疫小鼠，结合杂交瘤技术筛选特异性克隆，用于高灵敏度检测或靶向治疗。
2. 免疫学检测试剂盒开发
   • 竞争法 ELISA/CLIA：将睾酮 - OVA 偶联物包被于微孔板，与样本中的游离睾酮竞争结合有限量抗体，通过信号强度反推睾酮浓度（广泛用于临床血清检测、兴奋剂筛查）；
   • 化学发光免疫分析（CLIA）：偶联抗原与吖啶酯等发光标记物结合，实现自动化高通量检测。
3. 科研与工业检测
   • 环境激素监测：检测水体、土壤中睾酮类污染物（如养殖废水残留）；
   • 畜牧业：监测家畜（如种公牛）精液中的睾酮水平，评估生殖性能。

六、质量控制指标

睾酮单克隆抗体
一、基本概念
睾酮单克隆抗体是一类针对雄性激素 睾酮（Testosterone）特异性抗原表位制备的单克隆抗体。

单克隆抗体具有高度特异性和均一性，能精准识别睾酮分子的特定结构，在医学检测、生物学研究及临床应用中具有重要价值。
二、制备方法
睾酮单克隆抗体的制备通常通过杂交瘤技术完成，具体步骤如下：
抗原制备
将睾酮分子与载体蛋白（如牛血清白蛋白 BSA）偶联，形成免疫原，以增强免疫原性。
动物免疫
免疫小鼠或大鼠，刺激 B 淋巴细胞产生针对睾酮的特异性抗体。
细胞融合
取免疫动物的脾细胞（含 B 淋巴细胞）与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
筛选与克隆化
通过 ELISA 等方法筛选出能稳定分泌睾酮特异性抗体的杂交瘤细胞，并进行单细胞克隆化培养。
抗体生产
通过体外培养或动物腹腔注射杂交瘤细胞，收集腹水或培养上清液，纯化获得单克隆抗体。
三、主要应用
医学检测
睾酮水平测定：用于临床实验室检测血液、尿液等样本中的睾酮含量，辅助诊断内分泌疾病（如性腺功能减退、多囊卵巢综合征等）。
检测方法包括：放射免疫分析（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫分析（CLIA）等，单克隆抗体的高特异性可降低交叉反应（如与其他类固醇激素的干扰）。
生物学研究
免疫组化（IHC）：定位组织或细胞内睾酮的分布（如在睾丸、肾上腺等器官中的表达）。
免疫印迹（WB）：分析蛋白提取物中睾酮相关结合蛋白的表达水平。
中和实验：在细胞模型中阻断睾酮的生物学作用，研究其信号通路机制。
临床治疗（潜在应用）
部分研究探索将睾酮单克隆抗体用于激素依赖性肿瘤治疗（如前列腺癌），通过中和体内游离睾酮，抑制肿瘤细胞生长，但目前仍处于实验阶段。
四、优势与挑战
优势    挑战
1. 高特异性：仅识别睾酮分子，减少与其他激素（如雌激素、皮质醇）的交叉反应。
2. 一致性高：单克隆抗体批次间稳定性好，适用于标准化检测。
3. 灵敏度高：可检测低浓度睾酮（如 pg/mL 级别）。    1. 制备成本高：杂交瘤技术流程复杂，需专业设备和技术人员。
2. 动物源性免疫原性：鼠源单克隆抗体用于人体可能引发免疫反应，需进行人源化改造。
3. 检测方法依赖：需搭配特定试剂盒，部分基层实验室普及度有限。
五、相关检测指标与临床意义
正常参考值（血清睾酮）：
男性：2.8～11.0 ng/mL（不同实验室可能略有差异）；
女性：0.06～0.82 ng/mL。
异常升高：可见于肾上腺皮质增生、睾丸间质细胞瘤、多囊卵巢综合征（女性）等。
异常降低：见于性腺功能减退症、垂体功能低下、肝硬化等。