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UDP-Flavonoid glycosyltransferase (UFGT) Activity Assay kit
999
北京索莱宝科技有限公司
无
100T/96S
微量法
货号:BC5665
规格:100T/96S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体110 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
粉剂一 |
粉剂×1瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
液体40 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
试剂二 |
液体1 mL×1支 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×1瓶 |
-20℃保存 |
试剂四 |
液体80 μL×1支 |
2-8℃保存 |
试剂五 |
液体35 μL×1支 |
2-8℃保存 |
试剂六 |
粉剂×1瓶 |
-20℃保存 |
试剂七 |
粉剂×1瓶 |
-20℃保存 |
1、 提取液:临用前将粉剂一倒入提取液中,此溶液为悬浊液,使用前摇匀即可;
2、 试剂二工作液::临用前根据样本数量按照试剂一:试剂二=171μL: 9μL(180μL,2T)的比例配制,充分混匀,现配现用;
3、 试剂三 :临用前加入10 mL蒸馏水溶解,未用完的试剂分装保存,-20℃保存可以保存4周,避免反复冻融;
4、 试剂六:试剂放于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入6 mL蒸馏水,充分混匀,未用完的试剂分装保存,-20℃保存可以保存4周,避免反复冻融;
5、 试剂七:试剂放于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前加入6 mL蒸馏水溶解,未用完的试剂分装保存,-20℃保存可以保存4周,避免反复冻融;
6、 工作液:临用前根据样本数量按照试剂一:试剂四:试剂五:试剂六:试剂七=1.4mL:5μL:2μL:0.3 mL:0.3 mL(2007μL,约7T)的比例配制,充分混匀,现配现用。(试剂四、试剂五使用需先将液体离心至底部使用)
产品说明:
类黄酮糖基转移酶(UDP-glycose flavonoid glycosyltransferase, UFGT)是莽草酸途径的最后一个作用酶,也是使花色素形成稳定的花色苷的第一个作用酶,并使其由无色转为有色;UFGT是果实着色过程中的关键酶,它使不稳定的花色素转变为稳定的花色苷。
UFGT催化UDPG与槲皮素生成UDP和槲皮素糖苷;UDP在丙 酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下,氧化NADH为NAD+,NAD+生成速度与UDP含量成正比,通过340nm吸光度下降速度反映UFGT活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、蒸馏水和冰。
操作步骤:
一、 样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),
进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,紫外分光光度计用蒸馏水调零。
试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管 |
样本 |
20 |
- |
蒸馏水 |
- |
20 |
试剂二工作液 |
90 |
90 |
试剂三 |
90 |
90 |
混匀,30℃反应4h,95℃水浴10 min灭活,冷却至室温。10000g 4℃离心5min,取上清液待测。(在此期间将工作液37℃预热5min) |
||
上清液 |
30 |
30 |
工作液 |
270 |
270 |
将上清液和工作液分别加入微量石英比色皿中或96孔UV板中,立即充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃水浴或恒温培养箱2min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃),拿出迅速擦干测定2min10s时的吸光值A2。记录 340nm 下10s时吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2。计算A测定=A1测定-A2测定,A空白=A1空白-A2空白,∆A =A测定-A空白。空白管只需做1-2次。 |
1、按照蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每小时催化1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
UFGT活力(U/mg prot ) = ΔA×V反总II÷(ε×d)×109÷ (Cpr ×V样÷V反总I×V上清)÷T×F
= 4019.29×ΔA ÷Cpr×F
2、按样本质量计算
单位的定义:每g组织每小时催化1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
UFGT活力(U/g 质量) = ΔA×V反总II÷(ε×d)×109÷(W× V样÷V样总÷V反总I×V上清)÷T×F
= 4019.29×ΔA÷W×F
V反总I:30℃第一步反应体系总体积(V样+V试剂二工作液+V试剂三),0.2mL;V反总II:37℃第二步反应体系总体积,0.3×10-3L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:石英比色皿或96孔板光径,1cm;
V样:加入样本体积,0.02mL;V上清:第二步反应中上清液体积,0.03 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,4h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;F:稀释倍数;109:换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、 如果A1测定<A1空白或者ΔA大于0.5,,可以对上清液进行稀释或者缩短30℃反应时间重新测定;∆A<0.005,可以加大样本量或者延长30℃反应时间重新测定。最终计算时同步修改计算公式。
实验实例:
1、 称取0.1078g洋桔梗,加入提取液进行冰浴匀浆,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算A测定=A1测定-A2测定=0.9988-0.9807=0.0181,A空白=A1空白-A2空白=0.8157-0.8121=0.0036,∆A =A测定-A空白= 0.0145。带入公式计算:
UFGT活力(U/g 质量)= 4019.29×ΔA÷W= 540.63 U/g 质量
2、 称取0.1133g洋葱,加入提取液进行冰浴匀浆,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算A测定=A1测定-A2测定=0.8309-0.8157=0.0152,A空白=A1空白-A2空白=0.8157-0.8121=0.0036,∆A =A测定-A空白=0.0116。带入公式计算:
UFGT活力(U/g 质量)= 4019.29×ΔA÷W=411.51 U/g 质量
[1] Parvaneh, TaherehAbedi, BahramDavarynejad, Gholam HosseinMoghadam, Ebrahim Ganji. Enzyme activity, phenolic and flavonoid compounds in leaves of Iranian red flesh apple cultivars grown on different rootstocks[J]. Scientia horticulturae, 2019, 246.
[2] Mori K, Sugaya S, Gemma H. Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition[J]. Hort, 2005, 105(3):319-330.
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