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Phosphotransacetylase(PTA)Activity Assay Kit
999
北京索莱宝科技有限公司
BC5465-100T/48S
100T/48S
磷酸转乙酰酶(PTA)活性检测试剂盒说明书
微量法
货号:BC5465
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体60 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
液体15 mL×1瓶 |
2-8℃保存 |
试剂二 |
液体1.2 mL×1支 |
2-8℃保存 |
试剂三 |
液体1.3 mL×1支 |
2-8℃保存 |
试剂四 |
粉剂×2支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1. 试剂四:临用前取1支试剂四,加入0.6 mL蒸馏水充分溶解,未用完的试剂-20℃分装保存2周,避免反复冻融(1支试剂四溶解后可做60S,为了延长试剂盒使用时间,此产品多给1支粉剂)。
产品说明:
磷酸转乙酰酶(Phosphotransacetylase,PTA,EC 2.3.1.8)是与乙酸代谢相关的关键酶之一,乙酸在乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的作用下生成乙酰辅酶A,以此来连接糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化。PTA催化乙酰辅酶A和无机磷反应生成辅酶A和乙酰磷酸,该反应促使DTNB转变成黄色的TNB,其在412nm处有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、分析天平、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。
2. 细菌/细胞:按照细菌/细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌/细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎(功率200W,超声3秒,间隔7秒,总时间5min);然后12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,分光光度计蒸馏水调零。
2. 试剂一于25℃预热10min左右。
3. 操作表:
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
120 |
130 |
试剂二 |
10 |
10 |
试剂三 |
10 |
10 |
样本 |
50 |
50 |
试剂四 |
10 |
- |
将上述试剂按顺序加入微量玻璃比色皿/96孔板中,充分吸打混匀,记录412nm波长下15秒时的初始吸光度A1,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入25℃水浴准确反应2分钟(若酶标仪带有控温功能,将温度调至25℃);迅速取出比色皿并擦干,记录412nm波长下2分15秒时的吸光度A2,并计算ΔA测定=A2测定-A1测定,ΔA对照=A2对照-A1对照,ΔA=ΔA测定-ΔA对照。每个测定管需设置一个对照管。
三、磷酸转乙酰酶(PTA)活性计算
1. 使用微量玻璃比色皿测定:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
PTA活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样本)÷T=147.059×ΔA÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位的定义:25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
PTA活性(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W×V样本÷V提取)÷T=147.059×ΔA÷W
(3) 按细菌/细胞计算
单位的定义:25℃下每106个细菌/细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
PTA活性(U/106 cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(N×V样本÷V提取)÷T=147.059×ΔA÷N
ε:TNB摩尔消光系数,13.6×10-3mL/(nmol·cm);d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL; V样本:反应体系中加入的样本体积,0.05mL;V提取:加入提取液的体积,1mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;N:细菌或细胞总数,以106计。
2. 使用96孔板测定:
将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
注意事项:
1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失效。
2. 最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
3. 样本较多时,可根据样本数量按操作表配制工作液(试剂一、二、三),因通过单位时间内吸光值变化计算酶活,不推荐同时测多个样本。
4. 如果样本ΔA过低,可适当加大样本量后重新测定;如果样本ΔA大于0.6(微量比色皿)或者0.4(96孔板),建议将样本用提取液适当稀释后进行测定。注意同步修改计算公式。
实验实例:
1. 取0.1056g成熟梨果肉样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,离心后取上清,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得计算:ΔA测定=A2测定-A1测定=0.1013-0.0620=0.0393,ΔA对照=A2对照-A1对照=0.0571- 0.0558=0.0013,ΔA=ΔA测定-ΔA对照=0.0393-0.0013=0.0380,按样本质量计算酶活得:
PTA活性(U/g 质量)=147.059×ΔA÷W= 147.059×0.0380÷0.1056=52.919 U/g 质量。
2. 取5.76×106个细胞,加入0.8mL提取液进行冰浴匀浆,离心后取上清,按照测定步骤操作,用微量玻璃比色皿测得计算:ΔA测定=A2测定-A1测定=0.2411-0.1402=0.1009,ΔA对照=A2对照-A1对照=0.1775-0.1037= 0.0738,ΔA=ΔA测定-ΔA对照=0.1009-0.0738=0.0271,按细胞数量计算酶活得:
PTA活性(U/106 cell)=0.0271÷(13.6×10-3×1)×0.2÷(5.76×0.05÷0.8)÷2=0.554 U/106 cell。
参考文献:
[1] Michael M, Karin B, Wolfgang S, et al. Isolation and properties of acetate kinase- and phosphotransacetylase- negative mutants of Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus [J]. Microbiology, 1995, 141(11): 2891-2896.
[2] Miyake M, Kataoka K, Shirai M, et al. Control of poly-beta-hydroxybutyrate synthase mediated by acetyl phosphate in cyanobacteria[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 179(16): 009-5013.
[3] Bock AK, Glasemacher J, Schmidt R, et al. Purification and characterization of two extremely thermostable enzymes, phosphate acetyltransferase and acetate kinase, from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima[J]. Journal of Bacteriology, 1999, 181(6): 1861-1867.
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