果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)检测试剂盒

果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶（FBA）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号：BC2270
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液一	液体60 mL×1瓶	2-8℃保存
提取液二	液体60 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体25 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	粉剂×1瓶	-20℃保存
试剂三	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂四	液体20 μL×1瓶	2-8℃保存
试剂五	液体200 μL×1瓶	-20℃保存

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2. 试剂三：临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3. 试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
4. 试剂五：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：
果糖1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase，FBA）（EC4.1.2.13）是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与calvin循环的重要酶，催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙 酮和3-磷酸甘油醛，广泛存在于动植物及微生物体内，在各种逆境胁迫下表现不同的响应。
果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙 酮，在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙 酮生成NAD和α-磷酸甘油，340nm处吸光值的变化可反映果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、分析天平、低温离心机、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。
操作步骤：

• 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

①总FBA酶：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液一）充分冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细菌或细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
液体：直接检测。
②胞浆和叶绿体FBA酶的分离：

1. 按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5-10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），手工快速研磨或匀浆，之后于4℃，200g离心5min；
2. 弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min（离心时缓慢加速和降速）；
3. 取上清用于测定胞浆FBA酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，上清即为叶绿体中FBA酶活性。

建议测定总FBA酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的FBA，则按照步骤②提取粗酶液。
二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定：(在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂)

	测定管	空白管
试剂一（µL）	500	500
试剂二（µL）	100	100
试剂三（µL）	100	100
试剂四（µL）	100	100
试剂五（µL）	100	100
样本（µL）	100	-
蒸馏水（µL）	-	100
充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴5min，拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2，分别记为A1测定、A2测定、A1空白和A2空白，计算ΔA测定管=A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）

注意：如果检测样本量大，可以将试剂一、二、三、四、五按照5:1:1:1:1（V:V:V:V:V）的比例配成工作液待用（现配现用）。
三、FBA酶活计算

1. 按蛋白浓度计算

酶活单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算

酶活单位定义：每g组织每分消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

1. 按照细胞或细菌数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞或细菌每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷细胞数量（万个）
（4）按液体体积计算
酶活单位定义：每mL液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.001L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
注意事项：

1. 若ΔA大于0.8建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 若是植物样本，建议在提取完成后2h内检测完，如果样本量过大，建议分批提取、检测。
3. 由于提取液一中含有一定浓度的蛋白（约0.5mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度是需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1. 取0.1g小鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释8倍后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.257-1.06=0.197，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.164-1.16=0.004，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.197-0.004=0.193，按样本质量计算酶活：FBA酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×8（稀释倍数）= 321.54×0.193÷0.1×8（稀释倍数）=4964 U/g 质量。
2. 取0.1g绿萝加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.438-1.386=0.052，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.164-1.16=0.004，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.052-0.004=0.048，按样本质量计算酶活：FBA酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W= 321.54×0.048÷0.1=154.3392 U/g 质量。

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