本品来源于 E.coli,具有3'-5'外切酶活性,它作用于双链 DNA,从 3' OH 末端方向逐步切去单核苷酸;每次酶与底物结合催化,只有几个核苷酸被除掉,从而在 DNA 分子群内产生渐进缺失。该酶的最佳底物为平末端、5'突出末端双链 DNA 分子,但也可作用于双链 DNA 的缺刻处,从3'降解 DNA 分子,释放5'单核苷酸。对于3'突出末端,尤其是多于4nt 的几乎完全不切割, 亦不能切割硫代磷酰脂键。核酸外切酶 III 的活性部分依赖螺旋结构,并根据序列的不同而有差异(C>A=T>G)。另外,核酸外切酶III 还具有脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性、RnaseH 活性和3' 磷酸酶活性。