游离脂肪酸（NEFA）测定试剂盒

游离脂肪酸（NEFA）测定试剂盒
（比色法）
[注]：此实验须用分光光度计比色,不能用半自动、全自动生化分析仪及酶标仪比色。
一、测定原理：
游离脂肪酸（NEFA）能与铜离子结合形成脂肪酸的铜
盐而溶于氯仿中，其含量与游离脂肪酸含量成正比。用铜试
剂测定其中铜离子的含量，即可推算出游离脂肪酸的含量。
二、试剂组成与配制（50 管/48 样）：
试剂一：氯仿（分析纯），自备。
试剂二：缓冲液，40mL×1 瓶，室温保存 6 个月。
试剂三：铜试剂，甲液 30mL×1 瓶，乙液 30mL×1 瓶，丙
液 5mL×1 瓶，4℃保存 6 个月。试剂三铜试剂的
配制：按甲液∶乙液∶丙液=10∶9∶1 的比例进行
配制，需多少配多少，配好后 4℃可保存二周。
试剂四：显色剂，粉剂×2 支，稀释液 10mL×2 瓶，4℃保存
3 个月。试剂四显色剂的配制：临用时将 1 支粉剂
溶解于 1 瓶 10mL 稀释液中，配好后 4℃可保存二周。
试剂五：棕榈酸标准品粉剂×2 支，溶剂 50mL×1 瓶，4℃保
存 3 个月。1000µmol/L 棕榈酸标准品的配制：将
一支粉剂用溶剂溶解后定容至 20mL（注意用溶剂
将装粉剂的小离心管洗净）。
试剂六：双蒸水 40mL×1 瓶（做空白管用）。

[注]：详细操作步骤：
1、充分混匀准确抽提 2 分钟（用秒表计时）。如果您没有磨
口试管，可用普通玻璃试管代替，但必须用保鲜薄膜封
口，以便防止液体挥发及溅出。
2、抽提完后以 3500 转/分离心 10 分钟，若发现下层液体呈
半凝固状态、凝固层较厚或下层液体不足 2mL 时，则可
用小玻棒或移液器吸嘴轻轻搅拌后再次离心，直至分层
清楚。
3、 然后用注射器接上硬膜外麻醉针套吸取上层液体及凝固
层并弃之。
4、另取一个注射器及硬膜外麻醉针心针套，将硬膜外麻醉针
心插入针套中，小心插入下层抽提液中，拔出针心，接上
注射器，吸取下层抽提液 2.3～2.5mL 至另一试管中。（这
样可避免上层液体及凝固层混入下层液体中，若混入上
层液体及凝固层，则需重新离心后再取下层抽提液，否则
会影响结果。）若偶然发现抽提液有雾状混浊，可放入
37℃水浴 1～2 分钟即可。
5、再从上述试管中准确吸取 2mL 下层抽提液加入另一试管
中，加显色剂进行显色。

五、注意点：
1、实验必须用分光光度计比色，不可用酶标仪、半自动及全
自动生化分析仪比色（有机溶剂对这些仪器会有损坏）。
2、显色前吸取下层抽提液时，吸管不要触及管壁，以免沾染
管壁上粘着的铜试剂。下层抽提液必须清澈，否则会使结
果偏高。
3、胆红素可被试剂一抽提而干扰比色，故黄疸血清须做一对
照管，即最后不加显色剂而用正丁醇代替，在测定管光密
度读数中减去此对照管的光密度读数。
附录：实验中可能出现的问题
在做游离脂肪酸的时候空白很高，也有的老师操作结果中标
准和测定结果都很高，甚至能达到 3.000 以上，大多数情况下是
由于操作问题引起的，下面是关于 NEFA 实验所要注意的几个问
题：
1、在做组织样本的时候，不能将样本一起做成匀浆，因为组织
在做成匀浆后，很多指标含量都会快速下降。一般应该是上
午做好匀浆，下午就要测定完。样本太多一次不能操作完的，
当天能做几个样本就做几个匀浆，最好是按分组取样，每组
均要有样本参与，这样能减少批间差。
2、关于移液枪的使用，建议刚做实验的老师用倒退法加样，以
减少误差。并且在实验前最好能够多加练习，如反复移蒸馏
水，当加样熟练后，可进一步用无水乙醇和血清进行练习，
这样可以提高加样的准确性。
3、在 NEFA 的混匀过程中，最好用橡皮塞塞住试管口后，按住
试管上部混匀。切忌握住试管中部或者下部，因为这样会使
混匀不充分，导致抽提不充分。
4、实验时所用器皿应当仔细洗刷并且烘干，如果有污染，则可
能会对实验造成不必要的损失。例如：在配制铜试剂时，烧
杯不干净，则可能导致配制出的铜试剂浑浊，而非澄清透亮。
如果在实验过程中试管不干净，也可能引入杂蛋白，甚至造
成空白管也能出现中间蛋白层的现象。
5、试剂配制时应按照说明书的顺序进行。例如：在铜试剂配制
时，如果按照打乱顺序配制，即不按照甲、乙、丙的顺序，
那么也有可能会使配制好的铜试剂出现浑浊现象，从而不能使用。
6、实验时的自备试剂不能有污染，特别是蒸馏水，很多实验失
败都是因为最容易忽略的蒸馏水受到了污染，引入杂离子或者杂蛋白。
7、离心后的上层铜试剂建议客户用一次性注射器吸出。在吸下
层抽提液时，应该用适当大小的穿刺针，如果穿刺针过大，
例如用牛的穿刺针，有可能携带过多的上层铜试剂或者中间
的蛋白层，如果吸到上层的铜试剂，在比色中会使吸光度特
别高，引起结果偏差很大，并且做不同实验时所用的穿刺针
不应交叉使用，最好每个实验所用的玻璃移液管或者穿刺针
能够固定不变。（我所能够提供一次性注射器和相应的穿刺
针）（穿刺针即硬膜外麻醉针）
8、在比色过程中，应保证分光光度计使用恰当无误。比方说有
的老师在调零时，只用一个比色皿调零，另一个比色皿没有
冲洗和调零就直接使用，会造成初始值就偏高的现象，因为
比色皿会吸附颜色。
9、在配制试剂过程中，最好能够严格按照我们说明书上的量进
行准确量取，以加强实验的准确性，不能随便倒取。
游离脂肪酸（NEFA）测定试剂盒