病毒性神经坏死病病毒RT-PCR试剂盒

病毒性神经坏死病病毒RT-PCR试剂盒
产品及特点： 
病毒性神经坏死病病毒(Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV)是一种RNA病毒，会引起病毒性神经坏死病病毒病，患病鱼漂游于水面，并伴随有游泳不协调、螺旋状游泳等不同的神经症状，部分鱼眼盲，体弱，不摄食，体褪色或发黑，但未见出血或糜烂。该疾病流行于除美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100%，且近年受感染的鱼类种类和受危害程度迅速增加，因此快速灵敏诊断具有重要意义。为此本公司开发了本产品，可用于在科研领域快速定量检测病毒性神经坏死病病毒。它具有下列特点。
1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据病毒性神经坏死病病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 灵敏度可以达到1000拷贝/反应。
4. 使用一管式 RT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够50次20μL体系的RT-PCR。
6. 本产品由酶联生物提供，不得用于临床诊断。

规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	5×双酶一管式 RT-PCR Buffer	200 μL（橘黄盖）
试剂二	MMLV-Taq Mix	75 μL（红盖)
试剂三	超纯水	1 mL（亮黄盖）
试剂四	病毒性神经坏死病病毒RT-PCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂五	病毒性神经坏死病病毒RT-PCR阳性对照（1×10E8 /μL）	50 μL（黄盖）
试剂六	使用手册	1 份

注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA 片段作为阳性对照。 
运输及保存： 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。
自备试剂： 样品 RNA。
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR试剂盒
使用方法：  
一、样品 RNA 的制备： 
1. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL 病毒性神经坏死病病毒PCR阳性对照的 1000 倍稀释液作为制备的阳性对照。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
二、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系）：  
3. 如果有 N+2 个样品，则标记 N+4 个 PCR 管（额外增加的两个管一个是RT-PCR 阳
性对照，另一个是 RT-PCR 阴性对照）并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：

成份	N+2 个 样品管	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR 阳性对照
5×双酶一管式RT-PCR Buffer	各 4 μL	4 μL	4 μL
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR引物混合液	各 2 μL	2μL	2μL
N+2个制备的 RNA 样品	各 12.5μL	--	--
超纯水	--	12.5μL	--
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR阳性对照的1000倍稀释液	--	--	12.5μL
MMLV-Taq Mix	1.5 μL	1.5 μL	1.5 μL

4.上机进行 RT-PCR，RT-PCR 反应参数为:

过程	温度	时间
逆转录	42℃	30 min
预变性	95℃	5 min
PCR反应(35个循环）	95℃	30 sec
	58℃	30 sec
	72℃	20 sec
延伸	72℃	7 min

三、电泳检测： 
5. 琼脂糖电泳检测扩增效果。如果阴性对照有扩增产物或阳性对照无扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有扩增产物、阳性对照必须有预期条带出现，才有必要分析样品的实验结果，如果有预期片段大小的扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。