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人免疫缺陷病毒I型通用染料法荧
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人免疫缺陷病毒I型通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
大量
上海晶抗生物工程有限公司
无
50次
人免疫缺陷病毒I型通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒产品及特点: 人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus;abbr:HIV),即艾滋病(AIDS,获得性免疫缺陷综合征)病毒,是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。1981 年,人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒,属逆转录病毒的一种。目前全球流行的主要是 HIV-1。本产品是基于染料法荧光定量 PCR 原理开发,专门检测人免疫缺陷病毒 I 型通用的试剂盒。1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。2. 根据人免疫缺陷病毒I型通用的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。3. 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍,可以达到至少 1000 拷贝/反应。4. 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的 RT-PCR。规格及成分:
运输及保存: 低温运输、-20℃保存,有效期一年。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供 DNA 片段作为阳性对照。 自备试剂:样品 RNA 人免疫缺陷病毒I型通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒使用方法:一、稀释阳性对照:以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例,由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,用带芯枪头,下同)。2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。3. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 DNA 的制备: 5. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。 三、设置RT-PCR反应(20 μL 体系,在样品制备室进行): 7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后加):
注: 需使用 ROX 染料 I 的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。需使用 ROX 染料 II 的机型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。不需要使用ROX 的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
四、数据处理:10. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log 值,再推算出其浓度。11. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。所有产品仅供科研使用,不得用于其他用途。
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