Q1:通过Co-IP后WB验证发现,没有想要的目的条带?
1.有可能是样品被蛋白酶降解,对应的策略是需要添加蛋白酶抑制剂,所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融。
2.有可能是抗体浓度太低导致条带较浅,则需要调整IP或WB抗体浓度,必要时设立浓度梯度,摸索最佳浓度。
3.抗体亲和力太低,选用适合于IP或者WB的抗体。
4.有的IP抗体未与磁珠结合,这种情况需选用适合IP的磁珠。
5.若Tag未暴露在融合蛋白构象的表面,则需改变Tag融合表达部位。
6.裂解液盐碱度太高,需用低盐碱度的裂解液。
7.抗体选择不当,更换抗体。
Q2:通过Co-IP后WB验证发现,虽然可见目的条带,但是背景很高:
多方面原因造成:
1.由于非特异蛋白结合导致背景高,若要避色非特异性蛋白结合,则需要在无血清溶液中裂解细胞,且在免疫沉淀前用protein(A/G)珠子预洗,在免疫沉淀后增加漂洗次数和盐碱度(高盐或去垢剂)。
2.实验仪器或试剂被污染,使用洁净的仪器及试剂。
3.转移膜上的非特异吸附导致背景高,实验操作过程中戴手套,使用镊子来取,不要接触膜转移面。
4.制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体,则在制备样品后进行短暂超声处理(3次,每次5秒钟 ),然后离心,取上清后进行后续试验。
5.洗涤不彻底,则需要多次洗涤,并增加洗涤液中的NaCl和去垢剂浓度。
6.可能有非特异性蛋白吸附于珠子上,则须进行Preclearing以排非特异性吸附。
7.抗体本⾝待异性不好可能导致背景高,则须选择合适的抗体,可以考虑单抗。
8.使用了过多的细胞或组织进行裂解导致背景高,则须减少样本量,推荐100- 500μg细胞裂解液。
9.蛋白降解也可能出现高背景的情况,尽量使用新鲜制备的样品。
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