本试剂盒仅供科研使用
羧酸酯酶(CarE)活性测定说明书
(货号:WS8090W 微板法 96 样)
一、产品简介:
羧酸酯酶(CarE,EC 3.1.1.1)是一种广泛分布于细胞胞液、线粒体和内质网的多聚蛋
白,主要催化酯、硫酸酯和酰胺的水解,参与生物的解毒过程,被称为生物体内的清除剂。
羧酸酯酶催化乙酸-1-萘酯生成萘酚,进一步与固蓝显色剂反应生成有色物质,通过检
测该有色物质在 450 nm 处的光吸收增加速率,进而得出羧酸酯酶(CarE)活性大小。
二、试剂盒的组成和配制:
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、羧酸酯酶(CarE)活性检测:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min,
取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 450nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在 96 孔板中依次加入:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
提取液 110mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体 mg×4 支
-20℃保存
每支用前甩几下使试剂落入底部,再加
2mL 乙醇完全溶解备用,溶好的试剂可-20
度分装保存,禁止反复冻溶,变色即废弃。
试剂二
试剂 A:mg×2 支
试剂 B:空瓶×2 瓶 -20℃保存
每支用前甩几下使试剂 A 落入底部,加
0.1mL 乙醇使试剂 A 完全溶解,再全部转
移溶好的试剂
A 至一个试剂
B 空瓶中,接
着再向试剂 B 瓶中
加 9.9mL 试剂三混匀作
为试剂二备用。可-20 度分装保存,禁止
反复冻溶。
试剂三
液体 30mL×1 瓶
4℃保存本试剂盒仅供科研使用
2
【注】:1. 加完试剂二即启动反应,所以试剂二加完需立即检测,若 A1 值大于 0.4 或ΔA 大于 1,
可对样本进行稀释,稀释倍数 D 需代入公式重新计算。
2. 试剂一和二可预先按照比例 30:160 混合(用多少混合多少试剂量),然后加完样本后直接
加 190μL 混合液即可;若加样本后再加试剂一出现浑浊沉淀,则可预先使试剂一和二按
照比例 30:160 混合(用多少混合多少试剂量),加完样本后直接加 190μL 混合液即可;
3. 若ΔA 小于 0.005,可增加样本量 V1(如增至 30μL,试剂二相应减少),或延长反应时间
T(如由 3min 延长至 10min),则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本鲜重计算:
酶活定义:每克组织每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值增加 1 为一个酶活单位。
CarE(△OD450 /min/g 鲜重)=ΔA÷1÷(W×V1÷V)÷T×D =33.33×ΔA÷W×D
2、按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值增加 1 为一个酶活单位。
CarE(△OD450 /min/mg prot)=ΔA÷1÷(V1×Cpr)÷T ×D=33.33×ΔA÷Cpr×D
3、按细胞数量计算:
酶活定义:每 104个细胞每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值 1 为一个酶活单位。
CarE(△OD450 /min/104cell)=ΔA÷1÷(500×V1÷V)÷T×D=0.067×ΔA ×D
4、按液体体积计算:
酶活定义:每毫升液体每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值增加 1 为一个酶活单位。
CarE(△OD450 /min/mL)=ΔA÷1÷V1÷T ×D=33.33×ΔA×D
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.01mL;
T---反应时间,3 min;
W---样本质量,g;
D---稀释倍数,若未稀释则值为 1;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的蛋白含量测定试剂盒。
试剂名称(
μL)
测定管
对照管
样本
10
10
试剂一
30
30
蒸馏水
160
试剂二
160
加入试剂二后立即开始计时,37℃准确反应 3min 后在 450nm 处
读取吸光值 A,ΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。