本试剂盒仅供科研使用
丙*酸激酶(Pyruvate kinase,PK)试剂盒说明书
(货号:WS1180W 微板法 96 样)
一、产品简介:
丙*酸激酶(PK,EC 2.7.1.40)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化
糖酵解过程中的最后一步反应,是糖酵解过程中的主要限速酶之一,也是产生 ATP 的关
键酶之一,因此测定 PK 活性具有重要意义。
丙*酸激酶催化磷酸烯醇式丙*酸和 ADP 生成 ATP 和*酮酸,乳酸脱氢酶进一步催
化 NADH 和*酮酸生成乳酸和 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PK
活性。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 120mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 5mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
用前甩几下使试剂落入底部,再
加 10.2mL 的蒸馏水溶解备用。
试剂三
粉剂 mg×4 支
-20℃保存
每支用前甩几下使试剂落入底
部
,再加
0.55mL 的蒸馏水溶解备
用
。
用不完的试剂分装后
-20℃保
存,禁止反复冻融,三天内用完。
试剂四
粉剂 mg×1 支
-20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部,再
加 2.1mL 的蒸馏水溶解备用。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、丙*酸激酶(PK)酶活测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心 10min,
取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液;
冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104个):提取液(mL)为 1:1000~5000 比例进行提取。
③ 血清样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 依次在 96 孔板中加入:本试剂盒仅供科研使用
2
试剂名称(
μL)
测定管
样本
20
试剂一
40
试剂二
100
试剂三
20
混匀,37℃下,静置 10min 后
试剂四
20
混匀,37℃下,10s 时于 340nm 处读取吸光值
A1,5min 后读取吸光值 A2,△A=A1-A2。
【注】1.若△A 的值在零附近,可以适当延长反应时间到 15min 或更长读取 A2,改变后的反
应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量,则改变后的加样体积需代入
计算公式重新计算。
2. 若起始值 A1 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对
会偏高),可减少样本加样体积 V1(如减至 10μL,则补充 10μL 蒸馏水),则改变后
V1 需代入公式重新计算。或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm,
4℃离心 10min,上清液用于检测;
3. 若 A1 值低于 0.6 或△A 大于 0.6,可减少样本加样体积 V1(如减至 10μL,则补充
10μL 蒸馏水)或减少反应时间 T(如 2min),则改变后的 V1 和 T 代入公式计算。
4. 若下降趋势不稳定,可以每隔 10S 读取一次吸光值,选取一段线性下降的时间段来
参与计算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK(nmol/min/mg prot)=[ ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(Cpr×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算:
酶活定义:每克组织每分钟每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK(nmol/min /g 鲜重)=[ ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(Cpr×V1÷V)÷T =643.1×ΔA÷W
3、按细菌/细胞密度计算:
酶活定义:每 1 万个细菌/细胞每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK(nmol/min /104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA
4、血清 PK 活力计算:
酶活定义:每毫升血清每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PK(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=643.1×ΔA
ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm; d---96 孔板光径,0.5cm;
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.02 mL;
V2---反应体系总体积,2×10-4 L;
T---反应时间,5min;
500---细菌或细胞总数,500 万。
W---样本质量,g;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。