本试剂盒仅供科研使用
乙酰酯酶(Acetylesterase,AE)活性测定试剂盒说明书
(货号:WS8170W 微板法 48 样)
一、产品简介:
乙酰酯酶(EC 3.1.1.6,AE)已被证明是消除饲料细胞壁中阿魏酸等酚酸类木质素的关
键酶。可与其他细胞壁降解酶协同作用共同促进饲料等细胞壁的降解。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂×2 支
4℃保存
临用前每支加 0.6mL 无水乙
醇混匀溶解,仍 4℃保存。
试剂三
液体 6mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、蒸馏水。
四、乙酰酯酶(AE)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰
浴匀浆,4℃×12000rpm 离心 15min,取上清液待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或
细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔
10s,重复 30 次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:可直接测定,或者适当稀释后测定。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30 min,调节波长为 405nm。
② 所有试剂于 25℃水浴中预热 10 min。
③ 在 EP 管中依次加入下列试剂:
试剂名称(
μL)
测定管
对照管
样本
100
100
试剂一
220
240
试剂二
20
混匀,40℃孵育 30min。
试剂三
60
60
混匀,取 200μL 上清液至 96 孔板中(若有浑浊可
8000rpm 离心 5min 后取上清),于 405nm 读取 A 值,
ΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。
【注】:① 若ΔA 的值非常低在零附近,可增加样本量 V1(如增至 150μL,则试剂一相应减少)
或延长反应时间 T(如增至 60min 或更长),则重新调整的 V1 和 T 代入公式重新计算。本试剂盒仅供科研使用
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② 若△A 的值超过 1,则需要稀释样本,稀释倍数 D 代入计算公式;
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 0.0249x - 0.0042,x 是 PNP 摩尔质量(
nmol);y 是△A。
2、按照样本质量计算:
酶活定义:每克组织每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。
AE (nmol/min/g 鲜重)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(W×V1÷V)÷T×D=13.4×(△A+0.0042)÷W×D
3、按照样本蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克蛋白每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。
AE (nmol/min/mg prot)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(Cpr×V1)÷T×D =13.4×(△A+0.0042)÷Cpr×D
4、按细菌/细胞数量计算:
酶活定义:每 104个细胞每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。
AE (nmol/min/104 cell)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(500×V1÷V)÷T×D
=0.03×(ΔA+0.0042)×D
5、按液体体积计算:
酶活定义:每毫升液体每分钟水解底物产生 1nmol PNP 定义为一个酶活单位。
AE(nmol/min/mL)=[(△A+0.0042)÷0.0499]÷V1÷T=13.4×(△A+0.0042)
W---样品质量,g;
V---提取液体积,1 mL;
V1---上清液体积(mL),0.1mL;
T---反应时间,30 min。
D---稀释倍数,未稀释即为 1;
500---细胞数量,万;
Cpr---上清液蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(10μmol/mL):向标准品 EP 管里面加入 1.4ml 蒸馏水超声溶解。
2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品:0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2 μmol/ml。也可根
据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据对照管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。