本试剂盒仅供科研使用
细胞质异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)试剂盒说明书
(货号:WS2380W 微板法 96 样)
一、产品简介:
细胞质异柠檬酸脱氢酶即 NADP-异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH,EC 1.1.1.42)普遍存在
于真核及原核生物体内。是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 来源的重要途
径,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。
本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:利用 NADP-IDH 催化 NADP+产生
NADPH,接着与特异的显色剂反应,产生在 450nm 处有最大吸收峰的有色物质,通过
检测该有色物质在 450nm 的增加速率,进而计算出 NADP-IDH 酶活性的大小。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 15mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部,再
加入 2.2mL 蒸馏水溶解备用。
试剂三
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部,再
加入 3.2mL 蒸馏水溶解备用。
试剂四
液体 1mL×1 支
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、可调式移液器、、研钵、冰和蒸馏水。
四、NADP-异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上
清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取
液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm 4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 450nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 96 孔板中依次加入:
试剂名称(
μL)
测定管
样本
10
试剂一
130
试剂二
20
试剂三
30本试剂盒仅供科研使用
2
试剂四
10
混匀,37℃条件下,3min 时于 450nm 处读取 A1 值,避
光反应 30min 后读取 A2 值,ΔA=A2-A1。
【注】:若ΔA 过小,可以延长反应时间(如:60min 或更长),或增加样本量(如 30μL,则试
剂一相应减少)。调整后的反应时间 T 或样本体积 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.0807x - 0.0024,x 是 NADPH 摩尔质量:nmol,y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-IDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0024)÷0.0807]÷(V1×Cpr)÷T
=41.3×(ΔA+0.0024)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
酶活定义:每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-IDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0024)÷0.0807]÷(W×V1÷V)÷T
=41.3×(ΔA+0.0024)÷W
4、按细菌或细胞密度计算:
酶活定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-IDH(nmol/min/104)=[(ΔA+0.0024)÷0.0807]÷(500×V1÷V)÷T=0.083×(ΔA+0.0024)
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.01 mL;
W---样本质量,g。
500---细菌或细胞总数,万。
T---反应时间,30 min;若加大了反应时间,则重新调整的反应时间值要代入公式重新计算;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水(母液需在两
天内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际
样本来调整标准品浓度。
3 依据加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。