本试剂盒仅供科研使用
乙醇酸氧化酶活性测定试剂盒说明书
(货号:WS0160W 微板法 96 样)
一、产品简介:
乙醇酸氧化酶(GO,EC 1.3.3.1)是植物光呼吸过程中的关键酶,它催化乙醇酸氧化生
成乙醛酸,即植物光呼吸的底物。乙醇酸氧化酶与植物光呼吸、生长发育、矿质营养及感
病等密切相关。
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化成乙醛酸,生成的乙醛酸与苯*反应生成乙醛酸苯腙。乙
醛酸苯腙 324nm 处有最大吸收峰,通过测定乙醛酸苯腙的增加量,即可得出乙醇酸氧化
酶的酶活大小。
二、测试盒组成和配制:
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板(UV 板)、低温离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、乙醇酸氧化酶(GO)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心 10min,取上
清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 324nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 为了减少操作误差,建议使用排枪。
④ 依次在 96 孔板中加入:
【注】1. 加完试剂二即启动反应,所以试剂二加完混匀后立即检测,若 A2 值大于 1.5,可对样本进行稀
释,稀释倍数需代入公式重新计算。
2. 若ΔA小于0.005,可增大样本量V1(如增至20μL,提取液相应减少),或延长反应时间T(如
增至10min或更长),则改变后的V1和反应时间T需代入公式重新计算。
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 120mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 瓶
-20℃保存
临用前甩几下或离心,使粉体落入底
部,再加 2.6mL 蒸馏水混匀备用
试剂二
粉剂 mg×1 支
4℃保存
临用前甩几下或离心,使液体落入底
部,再加 2.5mL 蒸馏水混匀备用
试剂名称(
μL)
测定管
样本
10
试剂一
20
提取液
150
试剂二
20
混匀,立即于 324nm 处读取 A1 值,室温(25℃)反应 3min
后读取 A2 值。ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用
2
五、结果计算:
1、按质量计算:
酶活定义:每克组织每分钟催化生成 1nmol 的乙醛酸苯腙定义为一个酶活单位。
GO(nmol/g/min)=[ΔA÷(ε×d)×V2×103]÷(V1÷V×W)÷T×D=784.3×ΔA÷W×D
2、按蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化生成 1nmol 的乙醛酸苯腙定义为一个酶活单位。
GO(nmol/mg/min)=[ΔA÷(ε×d)×V2×103]÷(V1×Cpr)÷T×D=784.3×ΔA÷Cpr×D
ε---乙醛酸苯腙的摩尔吸光系数为17.0mL/μmol/cm;
d---光径距离,0.5cm;
V2---反应总体积,0.2mL;
V1---样本上样量,0.01mL;
V---提取液体积,1mL;
W---样本鲜质量,g;
T---反应时间,3min;
D---稀释倍数,若未稀释则 D 值为 1。